イリノイ大学: ニューロンの成長と電気生理学的記録のための粒子フリーの 3D プリント導電性ハイドロゲル

出典: ポリマー材料科学

最近、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校のチェン・ワン博士とラルフ・G・ヌッツォ教授のチームが、「先端機能性材料におけるニューロン成長と電気生理学的記録のための生体適合性導電性ハイドロゲルプラットフォームの 3D パーティクルフリー印刷」と題する論文を発表しました。彼らは、粒子を使用しない直接インク書き込み法を使用して導電性の 3D 周期的マイクロスキャフォールドを製造し、神経細胞の成長と電気生理学的記録のプラットフォームとして使用したと報告しています。ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）/ピロールインクは、ピロールの化学的インサイチュー重合に続いて、1μmほどの小さなノズルを通してハイドロゲル印刷に使用できます。これらの導電性ハイドロゲルは、複雑な 2D および 3D 構造のパターン化を可能にし、テストされた細胞培養との良好な生体適合性を示します (7 日後の生存率は約 94.5%)。ハイドロゲルアレイは、広範囲に培養されたカリフォルニア Ap 足神経節ニューロンの神経突起の成長を促進します。このプラットフォームでは、定常状態および刺激された電気的神経活動の細胞外電気生理学的記録が可能になります。要約すると、この 3D 導電性インク印刷プロセスにより、生体適合性がありマイクロメートル規模の構造を準備して、カスタマイズされた in vitro 電気生理学的記録プラットフォームを作成できます。

導電性ハイドロゲルの印刷と特性評価<br /> 直接インク書き込み用の新しいインクの設計により、細胞サイズスケールの特徴寸法を備えた電気生理学的ゲルプラットフォームの製造が可能になります。印刷可能な材料は、水性エタノール中のさまざまな分子量の pHEMA 鎖とピロール共モノマーの物理的に絡み合ったポリマーネットワークで構成されています。図 1 は、導電性ゲルスキャフォールドを得るためのこの構成と製造手順を概略的に示しています。 pHEMA ホモポリマー含有量は、直接インク書き込みのレオロジー要件と、細胞培養研究に適した機能性ゲル複合材料の要件を満たすように最適化されました。ポリマーネットワーク設計により、印刷プロセス中にピロールモノマーがハイドロゲルマトリックス内に閉じ込められ、その後の塩化鉄(III)処理により、得られた相互浸透ポリピロールのその場重合とドーピングが誘発されました。処理後数分以内に、印刷されたハイドロゲルは無色透明から濃い黒に変化し、重合とドーピングが目視できました。印刷されたパターンは徹底的にすすがれ、その後、未反応モノマーを除去するために、4 時間ごとに 4 回水を交換しながら脱イオン水に浸されました。この微細加工プロセスでは、インク印刷と導電性粒子のその場での形成が分離されるため、マイクロメートル範囲の特徴幅を実現できます。導電性フィラメントを簡単に、詰まりなく押し出すことで、複雑な 3D 構造を形成できます (図 2 を参照)。

図1 導電性粒子なしでのハイドロゲルの形成の模式図。上の行は印刷された構造のマクロビューを示し、下の行はハイドロゲル形成の 3 段階の微細構造を示しています。下の列の画像の緑色の線はポリHEMA鎖、黄色の三角形はピロールモノマー、茶色の点はピロールオリゴマー、黒色の点はポリピロール粒子を表しています。
図 2. ハイドロゲルインクの特性には、レオロジー挙動と安定した構造を形成する能力が含まれます。 a) インクの貯蔵弾性率 (G’) と損失弾性率 (G’’) を振動モードで 1 Hz で測定したところ、インクが液体のような応答を示すことがわかりました。 b) せん断速度の関数として測定されたインク粘度と、3D 印刷に必要なせん断減粘特性を示します。黒い線はせん断減粘指数を示しています。 c) 1 μm チップを使用して印刷されたパターンの透過光光学顕微鏡画像。小さなノズルを使用した印刷が可能であることを示しています。 d) インクの優れた 3D 構築性を示す、印刷された 3D ピラミッド構造の画像。モノフィラメントは矢印で示されています。
レオロジー特性は、3D 微細構造印刷に影響を与える重要な要素です。ここで、インクのレオロジー機能と印刷構造の例を図2に示します。レオロジー特性評価中、測定中の蒸発を防ぐために、水とエタノールの溶媒トラップを使用してハイドロゲルインクを水和状態に維持しました。 pHEMA-ピロールハイドロゲルインクの弾性率と粘性率は、インクフィラメントがその形状を維持しながら下層の隙間を越えることができるように最適化されました。

印刷されたフィラメント状（脱水）構造の SEM 分析（図 3a、b）により、硬化段階で形成された PPy の一般的な形態学的特徴が明らかになりました。これらの顕微鏡写真では、ナノ粒子の密に浸透したネットワークが明らかになりました（図 3c、d）。 pHEMA フィラメントネットワークは、より分散したマトリックスを形成し、複合材料の水和状態においてこの高密度のナノ粒子集団を物理的に閉じ込めました。構造の高倍率トップダウンビュー（図 3c）から判断すると、これらのナノ粒子は、純粋な pHEMA フィルムと印刷された構造によって形成された境界と比較して、複合材料の表面を著しく粗くします。フィラメント構造の高解像度断面 SEM 画像は、直径約 100 nm の PPy ナノ粒子がフィラメントの内部ドメイン全体に存在していることを示しています (図 3d)。

図3 印刷された「I」パターンのマクロ画像とSEM画像：a）1mmのスケールバー付きの印刷パターンの写真、b）（a）に描かれた単一の印刷ラインのハイライト領域の拡大画像（400nmのスケールバー付き）、c）100nmのスケールバー付き、およびd）500nmのスケールバー付きの導電性ハイドロゲルパターンの断面のSEM画像。
電気化学ワークステーションを使用して測定した複合ハイドロゲルの導電率を、4点プローブ測定の結果と比較しました（図4a）。図 4b に示すように、PBS 緩衝液中の Ag/AgCl の複数の CV スキャンを実行することによって、ハイドロゲルの電気化学的安定性を調査しました。複合ハイドロゲルの静電容量挙動とファラデー電流は、電荷転送効率に寄与し、最終的にはデバイス/バッテリーインターフェースで記録される信号の品質に影響します。著者らは、この材料の電気伝導体としての性能をマクロ的な観点からも評価した（図4c、d）。ここでは、複合ハイドロゲルスクリーンが印刷され、4.5 V LED 光源と電源を備えた回路に挿入されました。このデモンストレーションでは、5V DC のバイアス電圧を印加すると、印刷されたパターンが LED の発光をサポートできることが示されました。

図4 導電性ハイドロゲルインクの電気的および電気化学的特性。 a) 導電性ハイドロゲルフィルムのインピーダンス振幅対周波数のIV曲線とボード線図。固有導電率は13.59 S cm-1、正規化インピーダンスは8.4 Ω cm2である。 b) PBS 緩衝液中の導電性ハイドロゲルフィルムの Ag/AgCl に対する CV スキャン結果 (20 サイクル、スキャン速度 20 mV s-1)。ポリピロールの還元と酸化を示しています。 c、d) 印刷されたハイドロゲルメッシュを導体として回路に接続し、5 V を印加すると LED が点灯します。供給された電力に応じて LED が点灯したり暗くなったりすることで、ハイドロゲルメッシュの電気伝導性が実証されました。
複合ハイドロゲルの生体適合性の評価
pHEMA と PPy はどちらも細胞毒性が報告されておらず、さまざまなバイオ分析アプリケーションで活性物質および補助物質として広く使用されています。ここでは、新しい複合材料の直接的な生体適合性テストの結果を示します。このテストでは、この材料が培養中の正常な細胞成長パターンをサポートする基板として使用でき、さらにはガラス基板からの有用な形態の細胞移動と印刷された導電性フィラメントへの付着を促進できることが実証されています。これらの実験（図 5）では、デバイスを滅菌した後、実験セクションで説明したように、MC-3T3-E1 前骨芽細胞を、U 字型の複合フィラメントが印刷された導電性ハイドロゲルフィルムまたはガラススライド上に播種しました（図 5a ～ d）。 7 日間の培養期間中、フィルム支持培養における細胞生存率は生死アッセイを使用して評価され、1 日目、3 日目、7 日目に死んだ細胞 (赤) と生細胞 (緑) が数えられました (図 5b、e)。

図5 高い生存率を示し、細胞の移動を促進する導電性ハイドロゲルの生体適合性評価。 a) ハイドロゲルフィルム上での細胞培養実験の概略図、b) 導電性ハイドロゲルフィルム上で 7 日間培養され、生死アッセイで染色された骨芽細胞の蛍光画像。生きている細胞は緑色に、死んだ細胞は赤色に表示されます。 c) 印刷された U 字型の導電パターン上に移動する培養細胞の図。d) 7 日間の培養後、印刷されたフィラメント上に移動する細胞の蛍光画像。矢印は移動方向を示しています。 e) 1日目、3日目、7日目のハイドロゲルフィルム上の骨芽細胞の生存率。 f) ポリピロールを含まない pHEMA ハイドロゲル (黒) と導電性ハイドロゲル (赤) の PBS 緩衝液中の導電性ハイドロゲルと参照物質の表面電荷測定。単一培養ニューロンからの電気生理学的記録のための導電性インクベースのプラットフォーム<br /> インクの導電性と生体適合性により、培養されたニューロンの電気活動を研究するための電気生理学的記録プラットフォームを作製することができました (図 6a)。図 6b は、記録前の細胞と印刷されたアレイとの 2 種類の相互作用を示しています。これらの代表的なデータは、アレイの複合ハイドロゲル材料との接触を最大化するように相互作用する細胞の挙動を示しています。小さい細胞はアレイフィラメントの上部に中央に集まる傾向がありますが、大きい細胞は、隣接する 2 つのアレイフィラメントにまたがって広がることが一般的です。骨芽細胞と同様に、培養培地中に存在する正に帯電した表面は細胞の付着を阻害しなかったため、追加の表面処理は必要ありませんでした。図 6c は、記録グループと刺激グループから取得された電気生理学的記録と、それに対応する制御デバイスを示しています。対照的に、記録グループと刺激グループからの信号は活動電位を示し、記録実験と刺激実験の両方から代表的な単一スパイクが示されました（図 6d）。ニューロンとアレイの長期的な相互作用 (図 6e) は導電性ハイドロゲルの生体適合性を強調しており、培養 5 日後にはニューロンがアレイのフィラメントに沿って広範囲に成長していることが示されています。

概要<br /> 著者らは、優れた生体適合性と高い空間分解能を備えた 3D プリント可能な導電性ハイドロゲルインクを開発し、テストに成功しました。微小周期導電性アレイが製造され、ニューロンからの細胞外信号を記録するためのプラットフォームとして使用されています。このアレイは、定常状態と刺激状態の両方で神経活動の検出を容易にできることが実証されました。このプログラム可能な導電性ハイドロゲルは、ニューロンを含むさまざまな電気的に活性な細胞の in vitro および in vivo での活動を研究するのに役立つ、高い空間分解能を備えたプラットフォームを製造するための新たな機会を提供します。

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