骨芽細胞から骨細胞への効率的な分化を実現する生物学的3Dプリント技術の新たなブレークスルー

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

体外骨モデルは、骨組織の挙動と細胞反応を研究するための重要なツールであり、特定の骨の病理学的メカニズムを明らかにし、新しい治療法の効果を評価する上で重要な役割を果たします。しかし、現在の in vitro 骨モデルには、生理学的条件下での細胞とマトリックスの相互作用を完全に模倣できないことや、2 次元培養における骨細胞とその 3 次元細胞外マトリックスとの複雑な相互作用を正確に反映できないことなど、いくつかの制限があります。さらに、動物モデルは 3 次元環境を提供しますが、細胞環境を正確に操作する能力が欠けており、人間の組織を完全に表現することはできません。

したがって、人間の骨組織の生理学的特性を正確にシミュレートできる 3 次元の in vitro モデルの開発が急務となっています。このモデルは、3 次元環境に一次ヒト細胞を組み込み、骨芽細胞から骨細胞までの骨形成分化プロセス全体を正確に再現する必要があります。

この問題を解決するために、フランスのリヨンにある分子・超分子化学・生化学研究所の Emma Petiot 氏は、バイオ 3D 印刷技術を使用して、初代ヒト骨芽細胞の骨細胞への分化プロセスを促進できる体外骨モデルを開発しました。関連研究は、「骨芽細胞から骨細胞への分化を促進するインビトロバイオプリント3Dモデル」というタイトルでBiofabricationに掲載されました。

この論文は生物学的 3D プリント骨モデルに関するもので、主にバイオプリンティング技術を使用して骨芽細胞から骨細胞への分化を促進するための in vitro 骨モデルを開発する研究を紹介しています。

（１）バイオプリントされたヒト原発性骨芽細胞における骨細胞特異的タンパク質の初発現：本研究では、バイオプリントされたヒト原発性骨芽細胞における骨細胞特異的タンパク質PHEXの発現を初めて検出し、これはin vitro骨モデルの構築における重要な進歩を示すものである。

（２）ハイドロゲルの機械的特性の最適化による骨芽細胞の分化促進：ハイドロゲルの弾性率と粘弾性挙動を調整することにより、弾性率が8kPaで、経時的に粘弾性挙動を示すハイドロゲルが骨芽細胞の骨細胞への分化に最も適していることがわかった。

（３）細胞マトリックス相互作用の詳細な分析：本研究では、ハイドロゲルの収縮や細胞外マトリックスタンパク質（フィブロネクチンやコラーゲンIなど）の分泌など、細胞マトリックス相互作用を詳細に分析し、細胞が微小環境に積極的に影響を与える仕組みを明らかにした。

この研究は、骨病理学研究のための新しいin vitroモデルを提供し、骨細胞の分化と骨組織工学に対する理解を深めるのに役立ちます。

1. 生物学的 3D プリント骨モデルの構築と最適化<br /> この論文では、生物学的 3D プリント骨モデルの構築と最適化のプロセスを詳細に紹介します。

研究者らはまず、骨芽細胞を含む複数の細胞タイプの増殖に適していることが示されているゼラチン、アルギン酸塩、フィブリノーゲンで構成されたバイオインクを選択しました。次に、弾性率や粘弾性挙動などのバイオインクの機械的特性を、さまざまな架橋溶液によって調整しました。具体的には、研究者らは、TGHCa、TGLCa、およびTGHDMEMという3つの架橋条件をテストしました。これらはそれぞれ、ハイドロゲルの機械的特性を調整して骨芽細胞の分化をよりよくサポートするように設計されています。研究者らは、動的機械分析（DMA）や透過型電子顕微鏡（TEM）などの特性評価方法を通じて、ハイドロゲルの粘弾性と微細多孔性を評価しました。最終的に、TGLCa 条件 (弾性率 8 kPa および粘弾性挙動) を備えたハイドロゲルが、骨芽細胞から骨細胞への分化を促進するのに最も効果的であることが研究で判明しました。さらに、この研究では、構築された骨モデルが生体内の骨組織の生理学的環境を正確にシミュレートできるように、細胞密度や印刷形状などのバイオプリンティングパラメータも最適化しました。

これらの最適化措置により、骨モデルの生体適合性と機能性が大幅に向上し、骨組織工学および骨病理学研究のための新しい強力なツールが提供されました。

図1 バイオプリント構造における骨芽細胞の増殖
2. ハイドロゲルの機械的性質が骨芽細胞分化に与える影響<br /> この論文では、ハイドロゲルの機械的特性が骨芽細胞の分化に及ぼす影響を研究しています。

研究者らは、ハイドロゲルの弾性率と粘弾性挙動を調整することで、これらの機械的特性が骨芽細胞から骨細胞への分化プロセスにどのように影響するかを調査しました。具体的には、研究者らは、TGHCa（高弾性率および粘弾性挙動）、TGLCa（低弾性率および粘弾性挙動）、およびTGHDMEM（低弾性率だが弾性挙動）という異なる機械的特性を持つ3種類のハイドロゲルを調製しました。ハイドロゲルの機械的特性は動的機械分析 (DMA) によって特徴付けられ、ハイドロゲルの微細多孔性は透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用して分析されました。結果は、TGLCa 処理ハイドロゲル (弾性率 8 kPa、粘弾性挙動) が、細胞増殖の停止、アルカリホスファターゼ活性の増加、樹状突起の発達、および骨細胞マーカー PHEX の発現によって示されるように、骨芽細胞の分化を最も促進することを示しました。この発見は、ハイドロゲルの粘弾性挙動と適切な弾性率が骨芽細胞の分化を制御する上で重要な役割を果たしていることを浮き彫りにしています。さらに、この研究では、高多孔性ハイドロゲルが酸素と栄養素の拡散を改善し、骨芽細胞から骨細胞への分化をさらに促進できることも判明しました。

これらの結果は、ハイドロゲルの機械的特性が骨芽細胞の分化に及ぼす大きな影響を明らかにし、より効果的な骨組織工学戦略を開発するための重要な基礎を提供します。

図2 バイオプリント構造物の収縮
3. 骨細胞分化における細胞-マトリックス相互作用の役割<br /> この論文では、骨細胞の分化における細胞-マトリックス相互作用の役割を調査します。

研究者らはバイオ3Dプリンティング技術を用いて骨芽細胞を含むハイドロゲルモデルを構築し、細胞外マトリックスタンパク質を分泌して骨細胞の分化を促進することで細胞が微小環境にどのような影響を与えるかを分析した。具体的には、研究者らは、ハイドロゲル内で細胞外マトリックスの重要な構成要素であるタンパク質であるフィブロネクチンとコラーゲンIを分泌する骨芽細胞を観察した。研究者らは、免疫組織化学染色と透過型電子顕微鏡（TEM）分析により、TGLCa処理ハイドロゲルでは骨芽細胞から分泌されるコラーゲンIの量が大幅に増加し、ハイドロゲルが大幅に収縮したことを発見しました。これは、細胞とマトリックスの相互作用が骨細胞の分化に重要な役割を果たしていることを示しています。さらに、この研究では、細胞がハイドロゲルの微細構造を変化させることで分化のニーズに適応することも判明しました。たとえば、微細多孔性ハイドロゲルでは、細胞は酸素と栄養素をよりよく拡散できるため、骨細胞の成熟と分化が促進されます。

これらの結果は、細胞とマトリックスの相互作用が骨細胞の分化に必要であるだけでなく、ハイドロゲルの機械的特性と微細構造を最適化することでこのプロセスをさらに強化できることを示唆しており、骨組織工学に関する新たな洞察と戦略を提供します。

図3 骨芽細胞から分泌される細胞外マトリックスタンパク質図4 細胞外マトリックスの超微細構造解析
図5 骨芽細胞の形態の進化
4. 骨細胞特異的タンパク質の発現と同定<br /> この論文では、骨細胞特異的タンパク質の発現と同定、および生物学的 3D プリント骨モデルへの応用について研究しています。

研究者らは、最適化されたハイドロゲル内で骨芽細胞を培養することで、骨細胞の成熟の重要なマーカーである骨細胞特異的タンパク質 PHEX の発現を観察しました。研究者らは免疫組織化学染色により、TGLCa処理ハイドロゲルでは、培養21日後に骨芽細胞がPHEXを発現し始め、発現レベルが時間の経過とともに徐々に増加することを発見した。さらに研究者らは、アルカリホスファターゼ（ALP）活性を検出することで骨細胞の分化プロセスをさらに検証した。 ALP は骨芽細胞分化の初期マーカーであり、骨芽細胞が骨細胞に分化する過程でその活性は徐々に低下します。私たちの結果は、TGLCa 処理ハイドロゲルでは ALP 活性が最初に増加し、その後安定することを示しており、これは骨細胞の分化の典型的なプロセスと一致しています。

これらの結果は、バイオ3Dプリンティング技術によって構築された骨モデルが骨芽細胞の骨細胞への分化を効果的に促進し、骨細胞特異的タンパク質をうまく発現できることを示しており、骨組織工学および骨病理学研究のための新しい実験プラットフォームを提供します。

図6 アルカリホスファターゼ（ALP）活性の変化
図 7 骨細胞特異的タンパク質 PHEX の発現要約すると、本論文では、バイオプリンティング技術を使用して骨芽細胞を含む 3D 骨モデルを構築し、さまざまなハイドロゲルの機械的特性が骨芽細胞の分化に及ぼす影響を研究しました。結果は、骨芽細胞がさまざまなハイドロゲル内で異なる増殖および分化挙動を示し、それが具体的には細胞形態、アルカリホスファターゼ（ALP）活性、細胞外マトリックス分泌に反映されていることを示しました。細胞外マトリックスの超微細構造も透過型電子顕微鏡によって詳細に分析されました。さらに、この論文では、免疫組織化学染色によって骨細胞特異的タンパク質 PHEX の発現も特定されました。この研究は、骨芽細胞の分化を制御する上でのハイドロゲルの機械的特性の重要な役割を明らかにし、骨組織工学の将来の最適化のための重要な基礎を提供します。

将来的には、機械的刺激と共培養された破骨細胞が骨モデルの成熟に及ぼす影響をさらに調査し、より生理学的状態に近い骨組織工学モデルを実現できる可能性があります。さらに、ハイドロゲルの機械的特性と微細多孔構造を最適化することで、骨モデルの生体適合性や機能性を向上させ、骨関連疾患の治療に新たな戦略や解決策を提供することが期待されます。

出典: https://doi.org/10.1088/1758-5090/ad8ca6

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