術中バイオプリンティング：外科手術における組織と臓器の修復

出典: EngineeringForLife

術中直接3Dバイオプリンティング技術（以下、「術中プリンティング」という）は、損傷部位の情報を迅速に取得し、生体にバイオプリンティングを行って損傷した組織や臓器を修復することができる、効率的なバイオプリンティング戦略です。組織切除、外傷再建、または骨折修復を必要とする患者の場合、損傷部位の術中スキャンとバイオプリンティングは、修復の精度と効率を向上させる大きな可能性を秘めています。最近、ハルビン工業大学（深圳）のウー・ヤン教授は、ペンシルバニア州立大学のイブラヒム・T・オズボラト教授、ディノ・J・ラヴニック教授と共同で、「術中バイオプリンティング：外科手術における組織と臓器の修復」と題するレビュー記事をTrends in Biotechnology誌に発表しました。この記事では、工学的および臨床的観点からの術中プリンティングの主な限界、および将来的に研究室から臨床へと移行する可能性を紹介し、血管組織と複合組織の術中プリンティングに焦点を当てています。

1. 体外バイオプリンティングから術中プリンティングへ 過去 10 年間で、バイオプリンティング技術は大きな進歩を遂げ、組織再生、血管新生、薬物スクリーニング、疾患モデル化など、さまざまな組織工学分野に応用されてきました。しかし、バイオプリンティング作業のほとんどは試験管内で行われており、生体内でのさらなる検証が必要です。臓器を人体に直接印刷することは依然として非常に困難ですが、研究者たちはいくつかの試みを行っています。術中プリンティングは、インサイチュープリンティングまたはインビボバイオプリンティングとも呼ばれ、手術中に生体にバイオプリンティングを行う技術を指し、手術プロセス全体を通じて欠陥の画像化、データ処理、プロセスパスの計画、整然としたバイオプリンティングが含まれます。手術中に組織代替物を印刷することで、複雑な組織の異質性を解剖学的に正確に再現できるという利点があります。術中プリンティングはまだ臨床応用されていませんが、バイオプリンティング技術の急速な発展とさまざまな分野の研究者の共同の努力により、この分野は着実に発展しています。

術中印刷には多くの利点があります。まず、ハイドロゲルや細胞凝集体をベースにした組織代替物は、通常、水分を多く含むため初期の機械的特性が弱く、手術中に損傷しやすく、さらには崩壊してしまいます。対照的に、リバースエンジニアリング手法を使用してインプラントのリアルタイム設計を可能にすることで、術中印刷は汚染、構造崩壊、欠陥修復における手動介入のリスクを最小限に抑えることができます。さらに重要なことは、術中印刷により、臨床現場でのデブリードマンや組織切除によって生じる不規則な平面を持つ組織欠損に対処できることです。対照的に、in vitro バイオプリンティングでは通常、平らな作業面が想定されますが、これは臨床状況には対応していません。さらに、手術中に印刷された修復構造は天然組織で包まれるため、内因性細胞は印刷された構造内に移動でき、生化学的および物理的誘導を通じて標的組織特異性を持つ系統に分化することができます。さらに、欠損部位に生体材料を手動で注入する場合と比較して、術中印刷では細胞、遺伝子、サイトカインを正確に沈着させることができ、局所構造と解剖学的バイオニクスの正確な制御を実現します。異種細胞と局所的な層状細胞外マトリックスによって形成された組織の場合、術中印刷は、手動の方法では実現が難しい多層構造を正確に再構築する能力を備えています。最後に、ハイドロゲルの形状変形（皮膚再生中のコラーゲンの収縮など）も、in vitro 成熟中のバイオプリント構造が直面する問題です。さらに、細胞は体外培養中にマトリックスを再構築し、最終的には事前に設計された形態を変えたり破壊したりします。したがって、術中印刷の利点は、再生組織が生体内統合中に印刷された構造の収縮によって生じた隙間を埋め、マトリックスのリモデリングを調節する可能性があるという事実にも反映されています。

2. 術中プリンティングの最新の進歩 術中プリンティングの概念は2007年に初めて提案されましたが、生体内でのバイオプリンティングの実行が困難であったため、その後の研究報告はほとんどありませんでした。事前に準備された構造の移植と比較して、術中印刷では、バイオインクの準備、バイオ印刷装置、滅菌、および外科手術に対してより高い要求が課せられます。これまで研究者らは、術中印刷技術を利用して軟骨、骨、皮膚を修復してきました。たとえば、ハンドヘルドバイオインク押し出し装置は、羊の軟骨修復モデル（図 1A）や豚とマウスの皮膚修復モデルにそれぞれ使用されています。材料堆積プロセスは手動で実行されますが、ハンドヘルドデバイスは、ハイドロゲルの架橋に必要な外部機器を削減するための確立された戦略を提供します。骨の修復に関しては、ケリケル氏のグループは独自に開発したレーザーバイオプリンティングシステムを使用して、マウスの頭蓋骨欠損モデルで術中プリンティングを実行しました (図 1B)。彼らの追跡研究では、術中の印刷により、頭蓋骨欠損部の組織化された微小血管ネットワークと骨再生が生み出されました。現在、術中プリンティングの最も成功した事例は、皮膚へのアクセスのしやすさと再生能力の強さから、主に皮膚の修復に関連しています。最近、アルバンナグループはバイオイメージング技術を統合したモバイル皮膚バイオプリンティングシステムを開発し、マウスとブタの全層皮膚創傷モデルを修復しました（図 1C）。以下の記事では、術中印刷の主な技術的および臨床的限界に焦点を当て、血管組織および複合組織の再建における臨床応用の可能性を強調します。

図1 さまざまな組織修復におけるさまざまな術中印刷技術の応用
3. 術中プリンティングの焦点と将来展望
1. 現在のバイオプリンティング方法の限界 バイオプリンティングは、押し出し、液滴、レーザー技術に分けられます。既存の技術を術中印刷に直接適用するには多くの課題があります。押し出しベースのバイオプリンティングは、術中プリンティングに最も適していると考えられます。生体材料の手動注入（押し出し）は、何十年も臨床で使用されてきました。押し出しプリントヘッドは、泌尿器科や婦人科で現在使用されている手術ロボットに簡単に構成でき、術中の印刷が可能です。しかし、押し出しプリントヘッドは接触型がほとんどであるため、プリントヘッドが欠損部の周囲の正常組織に干渉する可能性があります。液滴印刷技術の場合、解像度は押し出し印刷よりも優れていますが、針穴でのバイオインクの沈殿により、ノズル詰まりのリスクが高まり、操作時間が長くなり、その他の合併症が発生します。印刷された構造の機械的特性が弱いという制限があるため、液滴ベースの技術は皮膚などの薄い組織の印刷に適しています。レーザー印刷技術には、液滴印刷と同様の利点（高解像度など）と欠点（印刷構造の機械的強度が低いなど）があります。レーザーベースの印刷デバイスの小型化も、そのコンポーネント（レーザー光源や光学コンポーネントなど）の複雑さのために課題となっており、生体内での深部組織印刷の可能性が制限されています。

2. バイオインクと外科手術環境の適合性 術中印刷の材料堆積は生理学的条件下で直接行われるため、理想的なバイオインクは一般的なバイオインクの要件を満たすだけでなく、1) 使用される印刷技術と互換性があり、手術時間を短縮するために術中印刷が可能であること、2) 印刷された構造の完全性と解像度を維持するために生理学的温度と湿度の条件下でその場で迅速に架橋できること、3) 手術コストを削減するために市販されており手頃な価格であることなど、いくつかの特定の特性も備えている必要があります。したがって、溶解するために揮発性有機溶媒を必要とする、または高温で溶融する必要がある最も一般的に使用される生体材料（ポリカプロラクトン、ポリ乳酸など）は、術中印刷には適していません。ハイドロゲルのうち、コラーゲンは 37°C でゲル状態に変化しますが、ゲル化が遅いため術中印刷には使用できません。しかし、ナノハイドロキシアパタイト強化コラーゲンは、骨組織の術中印刷において優れた性能を示しています。フィブリノゲンは、トロンビンとの交互印刷によって急速に架橋できるため、術中印刷にも人気があります。ゼラチンメタクリルアミド (GelMA)、ヒアルロン酸メタクリレート (HAMA)、ポリエチレングリコールなどの光架橋バイオインクもバイオプリンティングでよく使用されます。生体を紫外線に直接さらすと組織が損傷する可能性があるため、バイオインクの押し出しプロセス中に紫外線を透明なプリントヘッドの側面に向け、架橋と硬化を実現することが実行可能な解決策の 1 つです。最近では、細胞活性を破壊する紫外線架橋の使用を回避できるため、可視光光開始システムの使用が普及しています。既存のバイオインクに加えて、術中印刷に適した材料をさらに開発し、術中印刷の選択肢を増やす必要があります。新しい材料は、支持構造なしでバイオプリント構造の完全性を維持できるはずです。

3. 術中印刷プロセスの自動化 創傷の露出が長引くと手術合併症のリスクが高まるため、組織切除後数分以内に欠損部の撮影を完了する必要があります。この要件を満たすために、3D 写真測量に基づくスキャン技術は、欠陥領域の形態データを取得するための最適なソリューションを提供します。このようなスキャナーは、最大 30 μm の解像度を実現でき、スキャン時間が短く、持ち運びも可能です。さらに、画像の前処理、セグメンテーション、特徴抽出、データマイニングなどの画像処理も組織モデルの作成に不可欠です。術中印刷では、スキャンデータを取得してから数分以内に上記のすべてのプロセスが完了するはずです。したがって、関心領域の 3D 画像情報を簡単に抽出するには、優れた画像セグメンテーションソフトウェアが不可欠です。欠陥組織はそれぞれ独自のテクスチャ特性を持っているため、不適切な画像後処理によって意味のない 3D モデルが生成される可能性があり、モデルを慎重に評価する必要があります。人工知能とロボット工学は、画像処理時間とオペレーターのエラーを削減するのに役立ちます。これまで研究者たちは、例えばモーショントラッキングを使用して自由に動く手の解剖学的構造に印刷するなど、術中印刷の経路計画を最適化することに重点を置いてきました。将来的には、機械学習を使用して最適なバイオプリンティング戦略を自動的に生成することも可能になるかもしれません。

ハイドロゲルのゾルゲル変換と、手術中の生体動作（呼吸など）による形状変形のため、術中の印刷を自動化し、印刷精度を確保することは非常に困難です。この問題は、リアルタイムモニタリング技術を通じて印刷構造の変形を観察し、その後の材料堆積のためのフィードバック信号を提供することで解決されると期待されています。現在市販されている 3 軸バイオプリンティング装置は、不規則な形状の欠陥組織の術中プリンティングには不十分です。より自由度の高いプラットフォームが必要です。多自由度ロボットアーム (外科用ロボットなど) が理想的なソリューションとなる可能性があります (図 2A)。

4. 手術中の印刷組織の血管新生 血管新生は、バイオプリント構造、特に分節欠陥の成熟にとって非常に重要です。術中に印刷された組織の微小血管新生を促進するには、内皮前駆細胞、低酸素誘導因子、血管内皮増殖因子のバイオプリンティングなど、複数の方法があります。新生血管の形成が始まるまでには通常 10 日以上かかるため、酸素供給を延長するためにいくつかの時間的戦略を使用できる可能性があります。たとえば、酸素を豊富に含む微粒子や酸素を生成する生体材料をバイオインクに組み込むことで、毛細血管が血液を輸送できるようになるまで細胞に栄養を供給するようにバイオインクが設計されます。多孔質の内部構造の導入はバイオプリンティングの利点であり、宿主組織から印刷された構造への血液浸透を促進する別の選択肢も提供します。

術中印刷の最終的な目標は、動脈と静脈をつなぎ、埋め込まれた微小血管を含む構造を作成することです。超微小手術の発達により、内径150μm未満の微小血管の直接吻合が可能になりました。この技術の進歩により、インプラントは主要な血管樹にさらすことなく、素早く血流を実現できるようになりました。インプラントの吻合と血管新生を容易にするために、手術中に動静脈循環を作り出すためにさまざまな自己カテーテルを使用することもできます。

図2 血管新生複合組織の術中印刷と修復の模式図
5. 複合組織の術中印刷とその臨床的変化 現在、頭蓋顎顔面欠損（皮膚、骨、筋肉）、骨軟骨欠損（軟骨と骨）、筋骨格欠損（骨、筋肉、腱、皮膚）などの複数の構成要素を含む組織のシームレスな再建には、依然として限界があります。組織の種類によって生理学、解剖学、組織学が異なるため、異なる組織層を正確に印刷することが重要です。異なる部位の幹細胞を複数の系統に分化させることで、天然組織の解剖学的構造を模倣できるため、術中の印刷には幹細胞と分化因子の正確かつ効率的な沈着が必要です。筋骨格系を例にとると、内側から骨、血管、筋肉、皮下脂肪、皮膚組織が含まれ、10 種類以上の細胞が含まれています (図 2B)。

複合組織の術中印刷では、最小限の手動介入で欠損部位の情報を迅速に取得し、解剖学的正確性を確保する必要があります。印刷された構造は通常、天然組織の階層構造に従って設計されますが、印刷された組織は成熟中に構造と表現型が変化し、天然組織と異なる可能性があります。複合組織は厚いことが多いため、組織再生を促進するには血管新生が特に重要であり、血管新生が不十分だと欠損部位に壊死性瘢痕組織が形成されます。現在、複雑な分節欠損の修復には皮弁手術が標準となっています。皮弁は、ドナー組織とその血管茎（動脈と静脈）を一括して受容部位に移植する自家組織移植です。この技術は、大きな外傷や腫瘍の欠損の治療に革命をもたらしました。しかし、ドナー数の制限や皮膚フラップのドナー部位の病的状態により、その適用は制限されます。したがって、最善の解決策は、この外科手術の原理と術中印刷技術を組み合わせることです。外科医は、直接の血管吻合または誘導血管新生を介して、受容者の血液を隣接する印刷された構造に灌流することができます。この 2 つを組み合わせることで、ドナー数や罹患率に関する懸念が解消され、同時に置換組織との正確な一致が実現します。将来的には、バイオプリントされた組織工学インプラントが自家皮弁に取って代わる可能性があります。

術中印刷のもう一つの焦点は、天然組織と印刷された組織、特に無血管組織（軟骨修復など）の融合です。骨は本来、強力な修復能力を持っているため、軟骨は垂直方向に下にある骨と一体化することができます。骨と軟骨の界面を持つ複合組織の術中印刷も、軟骨の治癒能力を向上させる効果的な解決策であり、全層骨軟骨欠損の修復に適用できます。しかし、印刷された軟骨と天然の軟骨の横方向の接続は、永久的な軟骨置換を達成する上で大きな障害となるでしょう。外側軟骨の統合を強化するための戦略には、隣接する天然軟骨への直接接着を可能にするバイオインクの機能化が含まれます。
さらに、術中プリンティングに使用される現在の動物モデルには、皮膚や頭蓋骨の欠損など、荷重を支える組織が含まれていることはほとんどありません。将来的には、長骨の部分欠損や関節欠損などの荷重支持欠損モデルの修復に術中印刷を使用することがさらに注目されるでしょう。手術中に印刷された構造の機械的強度はバイオインクの固有の特性に依存しますが、これは新しい材料を開発することで改善できます。この点では、柔軟なバイオインクを熱可塑性バイオマテリアル（ポリカプロラクトンやポリ（乳酸-グリコール酸）など）と組み合わせ、熱可塑性材料の迅速かつ安全な冷却を可能にする印刷技術（レーザーベースの冷却システムなど）を開発することが考えられます。さらに、印刷された組織が十分な機械的強度を獲得するまで、定期的な術後ケアとリハビリテーションが依然として不可欠です。

IV. 結論 術中印刷は、軟骨、皮膚、骨などの組織再生などの用途で可能性を示しています。しかし、複合組織には軟組織、硬組織、およびそれらの間の界面組織が含まれており、その再生と修復は、高速で安定した架橋特性を持つバイオインクと高度なバイオプリンティング技術の開発に依存しています。さらに、血管新生を促進する実用的な方法を見つけることは、長期的な組織機能にとって非常に重要です。現在普及している皮弁手術に代わる方法として、バイオプリンティングと血管吻合術を組み合わせることは非常に魅力的です。長期的には、術中印刷の自動化は印刷プロセスの単純な統合であるだけでなく、バイオプリンティング戦略を最適化するために多数の臨床事例も必要になります。科学的な考慮に加え、術中プリンティングに関する臨床研究は倫理的および規制上の課題にも直面します。データベース構築のために患者情報を共有すると、個人情報と知的財産権の保護に関する課題が生じます。多くの問題に直面しているにもかかわらず、著者らは、術中印刷が組織や臓器の修復と再生の分野で大きな役割を果たすと固く信じています。

論文リンク:
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2020.01.004

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