血管新生と骨形成を改善するために間葉系幹細胞由来のエクソソームを搭載した 3D プリントの足場

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

頭蓋顔面骨の再生は血管新生と骨形成の結合したプロセスであり、感染と関連しており、外傷または腫瘍切除後の骨欠損においては依然として課題となっています。多機能な治療特性を持つ 3D 組織工学スキャフォールドは、感染した骨欠損部の血管新生と骨形成に多くの利点をもたらす可能性があります。最近、大連理工大学の研究者である宋克東氏と大連理工大学付属癌病院の医師である江大青氏は、中国科学院プロセス工学研究所の研究者である聶毅氏と共同で、押し出し3Dプリントを使用してマイクロチャネルネットワークが豊富なハイブリッドスキャフォールドを設計しました。このスキャフォールドは、脱細胞化細胞外マトリックス（dECM）、ゼラチン（Gel）、四級化キトサン（QCS）、ナノハイドロキシアパタイト（nHAp）（dGQH）で構成されています（図1）。

関連する研究成果は、「血管新生と骨形成を改善する間葉系幹細胞由来のエクソソームを搭載したdECM/ゲル/QCS/nHApハイブリッドスキャフォールドの3Dバイオプリンティング」というタイトルで、2023年2月9日に「Biofabrication」に掲載されました。

図1 dECM/Gel/QCS/nHAp@Exoハイブリッドスキャフォールドの製造とメカニズムの概略図
1. バイオインクの合成とレオロジー特性 著者らはまず、dGQ および dGQH バイオインクのレオロジー挙動をテストして、その印刷可能性を評価しました。図 2A-B に示すように、dGQ および dGQH バイオインクの複合粘度と貯蔵弾性率は温度の低下とともに増加し、調製されたバイオインクは良好な温度感度を持つことが示されました。さらに、nHAp含有量の増加によりゲルの相対濃度が低下し、dGQバイオインクと比較してdGQHバイオインクのプレゲル化温度が低下しました（図2E）。バイオインクの粘度はせん断速度の増加とともに低下します。これは非ニュートン流体とせん断減粘の典型的な挙動であり、特に押し出しベースの 3D 印刷システムに当てはまります (図 2F)。レオロジーの結果は、バイオインクが良好な印刷性と安定した物理的特性を持っていることを示しています。図 2I は、印刷されたスキャフォールドと、凍結乾燥前後のバイオプリントされたスキャフォールドを示しています。

図2 dGQおよびdGQHバイオインクのレオロジー特性
2. スキャフォールドの物理的および化学的性質 次に著者らは、まずスキャフォールドに引張試験と圧縮試験を実施し、その機械的特性を分析した。図 3C-F にそれぞれスキャフォールドの引張および圧縮応力-ひずみが示されているように、スキャフォールドの引張弾性率と圧縮弾性率は dGQ スキャフォールドよりも高くなっています。試験結果によると、nHAp は一定の範囲内でスキャフォールドの機械的強度を向上させることができますが、nHAp 含有量が高すぎるとスキャフォールドが脆くなります。著者らは、スキャフォールドの多孔性（図 3G）、タンパク質吸着（図 3H）、および温度安定性（図 3I）もテストしました。

図3 スキャフォールドの物理的および化学的性質
3. ステントの親水性、分解性、血液適合性 次に、著者らはスキャフォールドの親水性、分解性、血液適合性を調査した。図4A-Bは、20秒以内のこれらのスキャフォールド表面の水接触角の変化を記録しています。 nHAp の増加とともにスキャフォールドの接触角が増加することが直感的にわかり、nHAp がスキャフォールドの親水性を低下させる可能性があることを示しています。スキャフォールドが膨潤平衡に達すると、dGQH スキャフォールドの吸水率は dGQ スキャフォールドよりも低くなり、nHAp 含有量の増加とともに吸水率はわずかに減少しました (図 4C-E)。

図 4F の結果から、dGQ スキャフォールドは 2 週間以内に約 80% 分解し、3 週間までにほぼ完全に分解され、新しい骨組織の形成につながらなかったことがわかります。 nHAp の添加により、スキャフォールドの分解速度が効果的に低下しましたが、これは nHAp が酵素反応に与える立体障害効果によるものと考えられます。

さらに、溶血は生体材料の生体適合性を評価するための重要な指標です。ここでは、スキャフォールドのin vitro血液適合性を溶血アッセイによって評価した（図4G）。 nHAp の添加によりステントの溶血率は減少しました。 dGQHスキャフォールドの溶血率はすべて1％未満であり、dGQスキャフォールドの溶血率よりもはるかに低かった（図4H）。

図4 ステントの親水性と血液適合性
4. ステントの抗菌性 頭蓋骨の創傷修復に使用されるスキャフォールドの抗菌活性は、感染を防ぎ、欠損した骨の再生を促進するために必要であるため、著者らはスキャフォールドの抗菌能力を評価しました（図5）。スキャフォールド上で24時間培養した大腸菌と黄色ブドウ球菌のCFUは、dGQとdGQHスキャフォールドが顕著な抗菌活性を持つことを示した（図6A-B）。 nHAp の含有量が増加するにつれて、その抗菌活性は弱まりましたが、これは QCS の相対濃度の低下によるものと考えられます。 dGQH スキャフォールドの中でも、dGQH20 は優れた抗菌特性を持ち、骨組織工学における重要な応用が期待されています。

図5 ステントの抗菌特性
5. スキャフォールドの生体適合性と骨形成特性 次に著者らは、異なる量のnHAP（0、20％、30％、40％）を含むスキャフォールド上で培養したhBMSCの細胞接着、増殖、骨形成タンパク質の発現を評価した（図6）。結果から、nHAP の取り込みパターンと埋め込まれた nHAP の濃度によって細胞の生存率と増殖が変化するという結論が出されました。 nHAP は、nHAP がない場合に比べて細胞増殖の大幅な減少をもたらしました。つまり、スキャフォールド内の nHAP の量が増加するにつれて細胞増殖は減少しました (図 6A-B)。

スキャフォールドの骨形成特性は、ALP、Runx2、Ocn などの特定の骨形成分化マーカータンパク質の発現によって評価されました。 dGQH20スキャフォールドでは、ALP、Runx2、およびOcnの発現が有意に上昇していた（図6C）。これらの結果は、dGQH20 がウエスタンブロットデータと一致して、すべての骨形成段階で hBMSC の骨形成分化を効果的に促進することを示しました。これらのスキャフォールド上のhBMSCのミネラル沈着を決定するために、14日目にARS染色とV-Kossa染色を実施した（図6D）。

図6 スキャフォールドの生体適合性と骨形成特性
6. hADSCs-Exos の in vitro 生物学的特性とその足場特性 dGQH20、Exo、およびdGQH20@Exoスキャフォールドの生体適合性を評価するために、CCK-8アッセイでは、ExoグループのhBMSCの増殖が対照グループよりも有意に高いことが示されました（図7A）。独自のナノ構造を持つ 3D バイオプリントスキャフォールドでの培養により、dGQH20@Exo グループでは他のすべてのグループと比較して hBMSC の増殖がさらに促進されました。血管新生および骨形成タンパク質マーカーの発現に対する影響をさまざまなグループで調査しました。ヒトBMSCsは示された時点で採取され、ウエスタンブロッティングにかけられた（図7B）。 Runx2、Ocn、VEGF のタンパク質発現は、dGQH20 スキャフォールド上に固定化された Exos では、Exos を含まないそれぞれのスキャフォールドグループと比較して有意に高くなりました。

血管新生促進効果および骨形成促進効果をさらに評価するために、ARS、ALP、およびKossa染色のVを使用してhBMSCの骨形成分化を観察し、HUVECの創傷治癒、移動、および管形成における機能を測定した（図7C-D）。 ALP 染色の傾向と同様に、ARS および V on Kossa 染色では、dGQH20@Exo グループが他の 3 つのグループと比較して hBMSC の石灰化結節形成を大幅に増加させ、dGQH20@Exo グループの HUVEC の創傷治癒および移動能力が他のグループよりも大幅に強力であることが示されました。

図7 hADSCs-Exosのin vitro生物学的特性
7. 生体内骨再生および血管新生評価 dGQH20@Exo スキャフォールドの生物学的効果を in vitro で実証した後、dGQH20@Exo スキャフォールドの in vivo での骨形成および血管新生に対する有効性を調べました。スキャフォールドの生体内骨再生能力は、ラット頭蓋冠欠損モデルに10週間移植することにより調査され、スキャフォールドの生体内血管新生はマウス皮下移植モデルで評価されました。

欠損部における骨再生を観察するために、サンプルを切片に切り、H&E、マッソンTリコーム（MT）、ALP、Runx2、Ocn、CD31、VEGF抗体で染色した（図8A～C）。結果によると、ALP、Runx2、Ocn、CD31、VEGFの発現レベルはスキャフォールドグループの方が高く、特にdGQH20@Exoグループでは骨形成タンパク質と血管新生タンパク質の発現レベルが最も高かったことが判明しました。

図 8 生体内骨再生および血管新生評価要約すると、本論文では dECM ベースのバイオインクを調製し、押し出し 3D バイオプリンティング技術によって dECM/ゲル/QCS/nHAp 3D スキャフォールド (dGQH) を製造しました。スキャフォールドの形態、機械的特性、多孔性、親水性、生分解性、抗菌性、血液適合性、および生体適合性が特徴付けられ、評価されました。さらに、dGQH20 ハイブリッドスキャフォールドは、優れた抗菌活性と、優れた血液適合性および生体適合性を示しました。天然の骨の微細構造特性と血管新生骨再生の要件に着想を得て、血管新生因子と骨形成因子 (Exos) が静電相互作用に基づいて dGQH20 スキャフォールドに共に組み込まれました。結果は、添加された Exos がスキャフォールド上の細胞の付着と増殖を促進し、また、in vitro と in vivo の両方で dGQH@Exo スキャフォールドにおける骨形成と血管新生も大幅に増加したことを示しました。

ソース：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb6b8

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