【分析】組織工学軟組織の製造技術と積層造形

現在、中国における臓器提供の需要比率は150:1と高く、つまり1人のドナーの臓器を150人の患者が待っているという状況で、これは世界保健機関の統計比率20:1をはるかに上回っています。そのため、臓器移植や置換を人体組織や臓器の提供に頼るだけでは、もはや臨床医学のニーズを満たすことができません。米食品医薬品局は、人工組織・臓器の現在の潜在市場規模は4000億ドルにのぼると指摘しており、これが新興産業として発展し、移植技術や再生医療の発展を促す流れとなっている。組織工学は、足場、細胞、成長因子をシステムとして構築するものであり、再生医療における重要な研究課題である。しかし、足場は構造が複雑なため研究が困難である。付加製造技術は、あらゆる複雑な形状の構造部品を迅速かつ正確に製造することができ、従来の方法では実現が困難なステント製造の新しい手段を提供し、「バイオ製造」という新たな横断的な研究方向を形成します。
現代医学は、筋肉、血管、皮膚、肝臓などの軟部組織、骨などの硬部組織など、ほぼすべての人体組織や臓器の置換移植を完了させることができました。しかし、人体の天然組織や臓器を使用する場合でも、組織工学で作製した組織や臓器を使用する場合でも、大規模な組織や臓器の移植では、血管新生、つまり移植された組織が宿主の血管系と適合し、組織全体に広がる閉塞のない血管ネットワークを持っているかどうかが移植の成功の鍵となります。これは、広範囲に張り巡らされた血管網が人体の代謝を維持する主な手段だからです。全身に血液を循環させることで、酸素や栄養素の供給、代謝老廃物の排出が完了します。例えば、酸素の拡散距離は約150μmです。拡散だけに頼ると、血管から200μm以上離れた細胞は生存が困難になります。特に、大きな軟部組織の内部に存在する高密度細胞には、血液が灌流する血管系がつながっているだけでなく、心臓（心筋）や動脈（平滑筋）の筋肉収縮など、血流を促進する力も必要です。平滑筋は成熟した血管の壁膜にしか存在しないため、血管が発達した大きな軟部組織は、血管を含む軟部組織系でなければなりません。

この記事では、組織工学による軟組織に焦点を当て、現在の軟組織の製造方法をまとめます。細胞シート技術と脱細胞化スキャフォールド技術の開発は、それぞれ細胞とスキャフォールドの観点から機能的な血管化軟組織スキャフォールドを再構築するための基本条件を提供します。微細加工技術は、薄い組織切片に連続した微小血管ネットワークを事前に製造する方法を提供しますが、層間の結合と薄層の微細構造の形状保持が困難であり、複数の層を積み重ねて結合して大きな軟部組織スキャフォールドを形成するプロセスが複雑になり、微細構造の連続性が悪くなります。フォトステレオリソグラフィーや3Dプリントなどの付加製造技術は、微細構造を迅速に製造できるという利点があり、画像、CAD/CAE機能バイオニック構造設計、ハイドロゲル/細胞複合技術と組み合わせることで、大型血管化軟組織の研究に新しい製造方法を提供しています。関連する精密成形原理と装置の研究を早急に行う必要があります。

1 材料と方法
1.1 出典
2010年1月から2013年9月までのPubMedデータベースと中国国家知識基盤データベースで、軟部組織スキャフォールドの製造方法に関する論文をコンピュータ検索で探しました。英語の検索用語は「additive manufacturing、microfabrication、vascular tissue engineering、muscle tissue engineering、cartilage tissue engineering、stereolithography、3D printing、biodegradable hydrogel」、中国語の検索用語は「additive manufacturing、microfabrication、vascular tissue engineering、muscle tissue engineering、cartilage tissue engineering、photo-stereolithography、3D printing technology、biodegradable hydrogel」でした。

1.2 包含基準と除外基準
包含基準: 軟組織スキャフォールド用の脱細胞化スキャフォールドの製造に関する文献、軟組織スキャフォールドの微細加工方法に関する文献、軟組織スキャフォールドの付加製造方法に関する文献。除外基準: 反復研究および相関関係の低い研究。

1.3 データ抽出<br /> 英語では570件以上の論文が、中国語では2,900件以上の論文が検索され、合計3,470件以上の論文が検索されました。抄録は予備審査のために読み込まれ、本論文との関連性が低い論文はさらに除外されました。最終的に60件の論文が審査のために残されました。

1.4 品質評価
文献では軟部組織のニーズ、文献[20-38]では軟部組織の脱細胞化スキャフォールドとマイクロ製造方法、文献[39-60]では軟部組織スキャフォールドの製造における付加製造方法の応用について説明されている。

2 件の結果
2.1 軟部組織の要件
2.1.1 軟組織の生物学的要件<br /> 人体の軟部組織には、主に血管、筋肉、軟骨、内臓組織（肝臓や胆嚢など）が含まれます。組織が異なれば、生物学的要件も異なります。軟組織は単位体積あたりの細胞含有量が高いだけでなく、代謝における栄養供給、酸素、老廃物の輸送に対する要求も高いです。さらに、軟組織自体が体内で果たす機能は、特定の生物学的活動機能を満たす必要があります。組織が異なれば、生物学的要求も異なります。例えば、骨格筋には収縮性と興奮性があり、刺激を受けて骨を収縮させたり引っ張ったりすることで運動機能を実現します。そのため、骨格筋は機能を実現するために一定の機械的強度要件を満たす必要があります。同時に、刺激や信号作用下で収縮機能を実現することも求められます。血管は血液循環の通路です。血液輸送プロセス中、血管は強度要件を満たすだけでなく、血液循環の圧力に耐えられるように、ある程度の拡張性と弾力性も備えていなければなりません。さまざまな軟組織の研究では、自身の細胞の成長、増殖、分化に基づいてそれらの生物学的特性を観察し、生物学的要件を満たすためにシード細胞を使用することも必要です。

組織工学の軟部組織スキャフォールドは、天然の軟部組織の機能をシミュレートするだけでなく、軟部組織自体の生物学的要件も満たす必要があります。組織工学スキャフォールド自体を移植し、それを周囲の軟組織と組み合わせることにより、血管新生軟組織では、スキャフォールドを周囲の血管と組み合わせることも必要となり、血管新生が達成され、周囲の構造に酸素と栄養素が供給され、代謝老廃物が排出されます。さらに、スキャフォールドは細胞親和性の要件を満たし、免疫拒絶反応を回避し、スキャフォールド上の細胞の成長、増殖、分化を促進できる必要があります。また、細胞の成長などに三次元空間を提供するために、スキャフォールドには一定の水分含有量と透過性も必要です。

2.1.2 生体力学モデル
軟組織は、その機能特性に応じて、体内でその機能を実現するために特定の構造と材料特性を必要とします。軟部組織の形状は、マイクロCTと磁気共鳴画像（MRI）医療画像技術の助けを借りてスキャンすることによって取得され、組織の内部構造はスライスと組織学的染色によって取得され、全体的な解剖学的構造が得られます。軟部組織の機械的パラメータは、機械試験システムを使用して取得され、それによって軟部組織の生体力学的モデルが確立されます。モデルデータは、軟部組織の特性に応じて最適化され、ステントのパラメトリック製造を実現します。生体力学モデルを確立することで、モデルの構造と力学の関係を力学的な観点から分析し、加工中の構造の力学的な問題を解決することができます。人工組織の薄層とその組み立て方法の限界により、軟部組織とその血管新生に対する人工介入下での再建組織の性能を評価および予測するためにはまだ使用されていません。

2.1.3 組織工学材料
理想的な組織工学スキャフォールド材料は、優れた生体適合性、一定の機械的特性、調整可能な分解速度、非毒性、多孔性、細胞親和性、加工性、および再現性を備えています。ポリマーハイドロゲルは、一定の機械的強度と一定の多孔性を備えた含水材料であり、その多孔質内部構造は細胞増殖の微小環境をシミュレートし、足場内の細胞に3次元空間を提供し、自然環境における細胞の成長、這い回り、分化などを促進します。ポリマーハイドロゲルの三次元ネットワーク構造と粘弾性特性は、体内の生体高分子で構成される細胞外マトリックス環境特性に類似しており、ハイドロゲルはバイオメディカル材料として有用です。ハイドロゲルと細胞に基づいて調製された組織工学血管化スキャフォールドは、軟部組織スキャフォールドに広く使用されています。組織工学材料の開発過程において、ポリマーハイドロゲルの出現は、材料の面で軟部組織臓器の修復をサポートするようになりました。ハイドロゲルを効果的に利用して軟部組織スキャフォールドを作製することで、組織修復の目的を達成できます。

2.2 製造技術
2.2.1 脱細胞化スキャフォールド
大規模人工組織の製造方法に関して、国内外の研究動向は、現在、全体、層、層アセンブリレベルでの血管化スキャフォールドの製造という3つのレベルを形成しています。脱細胞化スキャフォールドは、天然組織から細胞を除去しながら細胞外マトリックスを保持し、典型的な一体型人工組織です。米国のピッツバーグ大学とテキサス大学による損傷した筋肉組織の研究では、大きな筋肉組織の欠損が筋肉量の大幅な減少を引き起こすことが示されています。移植された脱細胞化スキャフォールドは、宿主の筋肉細胞の移動と血管ネットワークの形成を誘導し、筋肉組織を再生することができます。ただし、修復の過程で、脱細胞化スキャフォールドを骨髄間葉系幹細胞と組み合わせて移植した場合にのみ、骨格筋の収縮機能を再構築できることがわかりました。これは、スキャフォールドを製造する際に細胞因子の影響を無視できないことも示しています。

人工足場全体と細胞の複合による人工軟組織の構築に関する研究では、多孔性細胞質マトリックスと形質転換成長因子β2や線維芽細胞成長因子2などの成長因子の複合により、骨髄間葉系幹細胞の成長、接着、分化を促進し、軟骨の修復を促進することができる。フランス、ラヴァル大学のBourgetらは、人体から線維芽細胞を抽出して培養しました。細胞培養により細胞マトリックスが生成され、組織シートが形成されました。組織シートは表面浸透圧を持ち、自己組織化細胞質マトリックス足場を形成しました。次に、平滑筋細胞を足場に移植して組織工学血管ネットワークを取得し、カールさせることで血管を備えた3次元足場が得られました。中国人民解放軍北京軍事医学科学院は、遺伝子組み換え細胞と他の細胞をコラーゲンと組み合わせ、血管付き人工心臓組織を作製した。ハルビン医科大学第二付属病院はコラーゲンを使用して心筋パッチを作成し、パッチ上にヒト骨髄間葉系幹細胞と内皮細胞増殖因子を移植した。この足場は、内皮細胞の生存率を向上させ、血管ネットワークの再生を促進することができる。多因子カプセル化と多細胞共培養技術は人工スキャフォールド血管新生の形成を効果的に促進できますが、新しい血管ネットワークのランダム構造は宿主組織の血管ネットワークと接続して成長することが難しく、その結果、大きな軟部組織インプラントの血管新生が困難になり、その後のスキャフォールドと宿主組織の成長と組織機能の再構築に直接影響します。

2.2.2 マイクロ製造技術
組織工学スキャフォールドの製造方法において、電界紡糸技術は、誘導極性繊維マイクロ薄層スキャフォールドを提供する。例えば、紡糸法を用いて極性方向を有する導電性ナノファイバーを調製する。ポリ乳酸-ヒドロキシ酢酸共重合体を導電性PANiと混合し、異なる濃度のナノファイバーを紡糸し、線維芽細胞をスキャフォールド上に移植して、組織工学筋肉スキャフォールドを得る。微細加工技術は、3 次元の所定のバイオニック血管ネットワークを構築する方法を提供します。西安交通大学は凍結乾燥法を用いてアガロース/コラーゲン多孔質足場を製造した。温度とpH値を変えて足場の孔構造と性能を制御することで、三次元の微細孔構造を持つ足場が得られ、その微細孔構造により細胞が広がることが可能になった。中国人民解放軍医科大学は、血管形成前のシート状の人工肝臓組織を体外で構築し、成長因子、細胞、マトリックス材料を混合してシートを作成し、それをラットの肝臓の表面に移植して、構造物と肝臓の間の血液連絡をできるだけ早く確立しました。

ハーバード大学医学部とケンブリッジ大学は、光硬化マスク法を使用して、溝構造を持つゼラチンゲル/細胞を製造しました。この方法では現在、流路構造の層しか生成できず、複雑な血管ネットワークを持つ組織のような臓器を生成するのは困難です。 Wang et al。は、シリコンプレートまたはPDMS表面の設計構造を実験金型として最初にフォトリソグラフィーを使用し、RGDS/YIGSRペプチド鎖が砂利を吸収していると型ride造りの標準にしたポリロク酸グリコール酸コポリマーフィルムをコーティングしました。米国のウェストバージニア大学は、微小流体性血管パイプライン構造を製造するためにマイクロファブリケーションを使用し、微小血管フローパラメーターモデルを取得し、二重層P眼鏡を使用しました製造プロセスは、パイプライン表面に毛穴を引き起こします。この技術は、連続した微小血管空洞と血管網を形成することができます。微細加工技術によりマイクロチャネルを作製し、組織工学用の血管形成を行います。東京大学では、微細加工技術を用いて心筋細胞と神経細胞を共培養し、培養系に電気刺激実験を加えることで、微細構造内での多細胞共培養を実現しています。

微細加工技術は通常、単層の薄膜構造を生成します。多層製造プロセスは難しく、複雑な積層および接着プロセスは層間接着能力に限界があり、層上の機能性コーティングも細胞の成長を阻害する効果があります。さらに、組織切片の機械的特性が悪いため、微細構造を維持することが困難です。組み立て後の3次元ネットワークの構造と連続性を確保することが難しく、栄養素の拡散が制限され、壊死を引き起こします。脱細胞化スキャフォールドは、天然組織の細胞マトリックスを利用することができ、生体適合性も良好です。しかし、脱細胞化スキャフォールドの細胞質マトリックスの機械的強度は不十分で、脱細胞化の過程でタンパク質残留物が発生すると、免疫拒絶反応を引き起こすため、その応用は限られています。マイクロ製造技術は薄い繊維層を製造しますが、ラッピング、スタッキングなどの方法でのみ3次元構造を維持でき、天然組織の形状をシミュレートすることはできません。3次元スキャフォールドの製造方法には、依然として技術的な欠陥があります。同時に、血管新生を実現するためのマイクロ流体製造のプロセス研究も、その構造と製造方法によって制限されており、スキャフォールドの血管新生の効果は乏しいです。しかし、近年、バイオメディカル分野では積層造形技術が急速に発展しており、ハイドロゲルの使用により、複雑な形状の生体模倣構造を持つ三次元スキャフォールドを効率的に製造する効果的な方法を提供できるようになりました。

2.3 積層造形技術
積層造形技術とは、あらかじめ設計された複雑な構造部品をコンピュータ技術によって構造単位である面、線、点のデータに離散化し、構造単位の整然とした積み重ねや集積を制御して直接3次元構造に加工する技術です。積層造形にはさまざまな方法があります。より成熟した成形方法には、光重合、熱溶解積層法、選択的レーザー焼結、3D 印刷技術、積層固体製造などがあります。これらの方法は、金属、セラミック、複合材、その他の材料の機械加工や生物組織工学の応用においてかけがえのない利点を持っています。その中で、バイオメディカルで主に使われる付加製造技術としては、光硬化技術、3Dプリント技術、熱溶解積層技術などがあります。光造形法や3Dプリントなどの付加製造技術は、バイオメディカル分野で使用される人工組織製造技術の重要な手段です。

フォトステレオリソグラフィーや 3D プリントなどの付加製造技術では、まず CAD を使用して組織の特定の構造を形作り、次にその内部の微細構造をモデル化します。シード細胞と生理活性因子を室温で生分解性材料に加え、層状に重ねて細胞質マトリックスのような微小環境を作成します。この微小環境は、付加製造によって製造された細胞キャリアフレームワークによって実現され、細胞の接着、増殖、機能化を促進し、最終的に組織工学の足場製造と組織修復の目的を達成します。現在、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、PPF/DEFなどの高分子ポリマーベースおよびマルチマテリアル傾斜構造の製造プロセスが開発されています。

同時に、ハイドロゲル、細胞、成長因子の複合技術の継続的な臨床的成功により、ハイドロゲル材料に基づく人工組織スキャフォールドの付加製造が新たな研究のホットスポットになりつつあります。西安交通大学は、独自に開発した光硬化成形機を使用して、複雑な形状と構造を持つ大型ポリエチレングリコールハイドロゲルスキャフォールドを製造し、光硬化ハイドロゲルスキャフォールドの構造精度を制御する方法と理論を構築しました。西安交通大学のBian Weiguo氏らは、ラピッドプロトタイピング技術を用いて、マクロとミクロが一体化した多孔質バイオセラミックス足場を製造した。多孔質足場は周囲の組織の成長を促進し、骨組織の血管新生を促進する。細胞実験では、ウサギの骨髄幹細胞が骨足場と軟骨足場によく付着して増殖し、細胞形態が徐々に成熟し、ラピッドプロトタイピング技術に基づく骨足場と軟骨足場の製造プロセスが優れたバイオセーフティを備えていることが証明された。

清華大学のヤン・ヨンニアン氏らは、離散スタッキングラピッドプロトタイピングとゾル/ゲル転移機構の原理に基づいて、細胞の直接3次元制御組み立てなどの技術を提案しました。コンピューター制御の下で、マトリックス材料と細胞が正確に配置および輸送され、直接組み立てられ、特定の空間配置を持つ細胞を持つ複雑な3次元構造を形成します。開発された低温堆積技術は、溶液を低温環境に押し込み、凍結・固化することで相分離を起こし、微細孔を形成します。凍結乾燥プロセスで蒸発すると、勾配孔構造を持つ足場が残ります。この多孔質勾配構造は、新しい組織の成長を促進します。英国シェフィールド大学のギル氏とクレイセンス氏は、マイクロ光硬化プロトタイピング技術を用いて生分解性ポリマー材料から物理的特性を調整できる足場を作成し、異なる成分の材料の光硬化成形プロセスを研究した。オランダのマインツ大学とトゥエンテ大学の Seck らは、高解像度の光硬化ラピッドプロトタイピング法を使用して、分解性ポリエチレングリコールとポリ D,L-乳酸を使用して 3 次元ハイドロゲル足場を製造しました。多孔質足場と非多孔質足場は、高い機械的特性を示しました。二十面体多孔質スキャフォールドは、細孔の連結性と機械的特性に優れており、細胞親和性に優れた構造で、細胞がこの材料上で良好に接着し分化することができます。

ラピッドプロトタイピング組織工学スキャフォールド製造のプロセスでは、細胞とスキャフォールドの統合製造が製造上の難しさになります。細胞とスキャフォールド材料の組み立て、材料のゲル化方法、in vitro での細胞の生存率に影響を与える要因などの問題を考慮する必要があります。したがって、生体外での生きた細胞の足場の作製により、血管新生の機能を実現できます。現在、細胞と足場の一体製造を研究する方法があります。例えば、イリノイ大学では、光硬化成形を使用して、異なる分子量のポリエチレングリコールジアクリレートハイドロゲルを細胞と成長因子と混合し、加工技術を研究し、単一細胞単一材料の3次元生体細胞足場と複数細胞多重材料の3次元生体細胞足場を製造し、細胞生存率などを通じて足場材料と製造方法を評価しています。ピッツバーグ大学医学部は、投影光硬化技術を使用してハイドロゲルで生体細胞足場を製造しました。ポリエチレングリコールジアクリレートをヒト脂肪幹細胞とさまざまな濃度の光開始剤と混合し、細胞の成長に影響を与える要因を観察しました。この方法により、大規模な多孔質軟組織3次元生体細胞足場を効果的に製造できました。しかし、3 次元スキャフォールドでは細胞の成長に一定の制限があり、大きな軟部組織スキャフォールドの血管新生の問題に対する信頼できる解決策はありません。

3Dプリント技術はバイオ製造や医療の分野に応用されている。2009年、アメリカのGanovo社は3Dプリント技術を使って初めて人工血管を製造した。2010年にはオーストラリアのInvetech社とアメリカのOrganovo社が協力し、生きた細胞を使って人間の組織や臓器をプリントする試みを行った。南カリフォルニア医科大学とミシガン大学は、アガロースを支持体として使い、3D 印刷装置を使用して混合細胞液滴 (300～500 μm) を印刷し、直径 3 mm 未満の血管分岐ネットワークを作成しました。

ハーバード大学医学部は、複合細胞に使用できるコラーゲンハイドロゲルの層ごとの印刷装置を製造しました。製造スキャフォールドを図 2 に示します。このデバイスの製造における主な問題は、コラーゲンハイドロゲルのゲル化速度が遅いためにハイドロゲルの製造時間が長くなりすぎて、ハイドロゲル内の細胞の活動に影響を与え、人工軟組織のニーズを満たすことが困難になることです。ペンシルバニア大学、マサチューセッツ工科大学などは、犠牲材料を使用して血管ステントを製造しています。

まず、多糖類の管状ネットワーク構造を3Dプリンターでロストフォームとして印刷します。ロストフォームの外層にポリ乳酸-グリコール酸共重合体の層をコーティングすることで、多糖類の管状ネットワークが溶解した際に液体が外部に浸透して外部マトリックス環境に影響を与えることを防ぎます。製造された多糖類管状ネットワークを鋳型に入れ、細胞包埋用ハイドロゲルまたはポリマー材料を鋳型に流し込み、材料を固化させることで、細胞と多糖類管状ネットワークを生体材料に包埋し、多糖類管状ネットワークを溶解して排出することで、最終的に血管構造を有する生体細胞の三次元足場が完成します。付加製造はマクロおよびミクロ構造の形成を実現でき、他の製造方法と組み合わせることで、軟組織スキャフォールドの製造要件をより大きく満たすことができます。

しかし、ハイドロゲルと細胞複合積層造形の現在の成形メカニズム理論には依然として欠点があります。たとえば、3D 印刷技術の場合、成形精度に最も影響を与える要因は細胞液滴の粘弾性と表面張力です。第二に、足場材料の応用研究を早急に行う必要がある。現在使用されているアガロースやコラーゲンなどのハイドロゲルの強度は高くなく、新たに形成された細胞外マトリックスは、人工組織構造を短期的に維持することが困難です。近年、高強度ハイドロゲルの開発は、耐裂性、高細胞含有量の人工軟組織の開発に向けられており、例えば二重ネットワークハイドロゲルは、その光硬化成形特性を活用し、その製造方法を高精度成形光硬化プロトタイピング技術と組み合わせて連続した空間血管ネットワークを形成できれば、微細製造技術における積層の難しさや強度不足の問題を解決できる。あるいは、磁性ハイドロゲルを使用し、磁性材料を介して強度の問題を解決し、ハイドロゲル内の細胞の成長を促進して、大規模な軟組織三次元生体細胞スキャフォールドの構築を実現する。しかし、関連する成形原理や構造精度に関する現在の研究はまだほとんど空白状態である。要約すると、フォトステレオリソグラフィーによる付加製造と 3D 印刷技術には、機能化された構造設計と多細胞/多材料複合製造を組み合わせる利点があります。高強度、高細胞含有量のハイドロゲルの精密成形光硬化付加製造技術と3次元印刷技術の開発は、人工組織足場の製造とその血管新生のための重要な手段および研究のホットスポットになりつつあります。

3 議論<br /> 現在、組織工学研究の分野では、人工軟組織生体細胞血管化足場の成形を研究するための方法が数多く存在します。本論文では、多材料、多細胞、血管化生体細胞スキャフォールドの製造における付加製造方法の特徴と欠点に焦点を当て、軟組織スキャフォールドの製造方法を分析、まとめています。ハイドロゲル/細胞複合構造は軟組織スキャフォールドの鍵であり難しさであると考えられており、関連する高精度付加製造技術の原理と製造プロセス、およびハイドロゲル、細胞、成長因子の組み立て方法は、この難しさを克服するための中核技術です。技術的難しさは、移植・再生医療分野における積層造形の応用に関する基礎研究のみならず、ハイドロゲルや細胞などの軟質材料を積層造形によりハイブリッド成型するための高精度装置に関する基礎理論研究でもある。

著者: Lian Qin、Li Dichen、Chen Cheng、Zhang Weijie、Liu Yaxiong、He Jiankang、Jin Zhongmin (西安交通大学機械製造システム工学国家重点実験室)

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