熱可塑性エラストマー 3D プリント + ホットスタンピングにより心臓チップデバイスの自動製造を実現

出典: EngineeringForLife

臓器チップデバイスを成功裏に実現するには、デバイス製造用の自動化ワークフローの開発が必要ですが、これには、マイクロメートルスケールの構成で複数のクラスの材料を正確に堆積する必要があるという課題があります。現在、多くの心臓チップデバイスは手作業で製造されており、熟練したオペレーターの専門知識と器用さが求められます。

この問題に対処するため、カナダのトロント大学のミリカ・ラディシック氏のチームは、自動化されスケーラブルな製造方法を設計し、Biowire II マルチウェルプラットフォームを設計してヒト iPSC 由来の心臓組織を生成できるようにしました。この高スループットのハートオンチッププラットフォームでは、量子ドット (QD) と熱可塑性エラストマー (TPE) で作られ、ホットエンボス加工によってポリスチレン組織培養基板上に 3D プリントされた蛍光ナノ複合マイクロワイヤを力センサーとして使用します。デモンストレーションとして、著者らは、長期の電気変調、刺激、およびその場での収縮評価のために、内蔵の導電性カーボン電極と TPE/QD ナノ複合マイクロワイヤをマルチウェルプレートデバイスに自動的に統合しました。さまざまなマルチウェルデバイスにおける電界分布を数学的にモデル化し、組織培養のための均一な電界を確保するために電極の位置とウェルの形式を最適化しました (図 1)。

関連する研究成果は、「熱可塑性エラストマーナノ複合材料の3Dプリントとホットエンボス加工によるスケーラブルなハートオンチップデバイスの自動製造」というタイトルで、2023年11月7日に「Bioactive Materials」に掲載されました。

図1 成熟ヒトバイオワイヤーII心臓組織を培養するためのマルチウェルプレートデバイスのスケーラブルな製造の概略図

1. 効果的なデバイス設計のための電界分布の有限要素モデリング

マルチウェルプレートの 1 つのフットプリント上に存在する組織の数を増やすと (つまり、24 ウェルプレートから 384 ウェルプレートに移行すると)、薬物検査のスループットが大幅に向上します。しかし、薬物試験および成熟のための効果的な組織ペーシングを達成するには、ウェル内の均一な電界分布が必要であり、これによりプレート上の生存組織の量に下限が課される可能性があります。細孔内の炭素電極周囲の電界分布の有限要素モデリングを実行すると、標準設定（10 cm 皿内の Biowire II ストリップ）と多孔モデルの間で、細孔サイズの関数としての電界分布に変化が見られました（図 2A）。具体的には、10 cm ディッシュの培養培地内の 2 つの電極間の電界分布は、多孔質モデルと比較してより均一でした (図 2B-C)。 FIG2D は、中心平面内の組織に近いハイドロゲルの軸方向に沿った電界 (V/m) のラインプロファイルを示しています。電界が印加されると、マイクロワイヤ壁付近の電界強度はすべてのモデルの平均値よりも大幅に高くなります。全体的に、24 ウェルおよび 96 ウェル構成でのフィールド分布が強化されたため、384 ウェル構成に比べて 24 ウェルおよび 96 ウェル構成の製造がさらに適用されました。

図2 Biowire II培養装置とマルチウェルプレート装置における電界分布

2. 自動化されたマルチウェルデバイス製造により、Biowire IIセットアップの手動製造よりも効率が向上します。

ホットエンボス加工と 3D 印刷技術 (図 3A) を組み合わせてマルチウェルプレートデバイスを製造すると、オペレーターによる手動操作と挿入の手順が不要になります。このプロセスにより、各ウェルに均一な TPE/QD マイクロワイヤと平行カーボン電極を備えた 24 ウェル (図 3B-D) および 96 ウェルプレートデバイス (図 3E-G) を形成することができました。標準のBiowire IIプラットフォームとマルチウェルプレート装置の製造ステップを詳細に比較すると、各ステップの製造時間に大きな違いがあることが明らかになりました（図3H）。この自動化された製造プロセスにより、各プラットフォームの製造時間は3890分（Biowire IIセットアップ）から70分（24ウェルプレート）および74分（96ウェルプレート）に大幅に短縮されました（図3I）。組織ウェルあたりの時間を考慮すると、生産時間は 483 分 (Biowire II) から 2.9 分 (24 ウェル)、さらに 0.77 分 (96 ウェル) に短縮されました (図 3J)。この新しい製造プロセスにより、以前は完全に手動のプロセスで製造されていた Biowire II プラットフォームが、8 マイクロウェルチップからパターン化された 24 ウェルまたは 96 ウェルプレートにスケールアップされ、24 ウェルプレートではマイクロウェルあたりのプラットフォーム製造が 17,500% 高速化され、96 ウェルプレートでは Biowire II プラットフォームよりも 69,000% 高速化されました (図 3K)。

図3 24ウェルおよび96ウェルプレートでの心臓オンチップデバイスの自動製造

3. ナノ複合マイクロワイヤの特性評価

次に、弾性マイクロフィラメントのたわみによって引き起こされる心臓組織の収縮挙動を検出するために、スチレン-エチレン/ブチレン-スチレン（SEBS）ブロック共重合体、すなわち熱可塑性エラストマーを使用して、コアシェルCdSe / ZnS量子ドット（QD）を通して蛍光を発しました（図4AおよびB）。著者らはナノ複合インクをカスタマイズし、異なる励起波長を使用して励起できるさまざまな分解可能な色でマイクロメートルライン（直径60±4μm）に印刷しました（図4A-B）。ナノ複合フィルムを培養培地に最大1か月間浸漬した後も、TPE/QDナノ複合材料は劣化を示さず（図4C）、長期細胞培養に適した安定性があることが示されました。ナノ複合マイクロワイヤ内の量子ドットは、マイクロワイヤの曲げ特性 (図 4D および E) と剛性 (図 4F) を変化させず、TPE マイクロワイヤと同様の力 - 変位曲線を示しました。この特性を活用して、マルチウェルプレートデバイス内のナノ複合マイクロワイヤを力センサーとして使用し、心臓組織の収縮挙動を監視しました。 TPE/QD のヤング率は POMAC よりも大幅に高くなりますが、両方の値は天然心臓の弾性と同様です。

図4 マルチウェルプレートセットアップで組織アンカーおよび変位センサーとして使用されるナノ複合マイクロワイヤの特性評価

4. hiPSC由来心臓組織の成熟<br /> 電界分布の全般的な改善により (図 2)、成熟研究は、天然心筋と同様の機械的特性を示した 60 μm マイクロワイヤを備えた 24 ウェルプレートデバイスに重点が置かれました。新しいプラットフォームの細胞適合性は、新生児ラットの心臓組織で初めて検証されました。心臓線維芽細胞は、ハイドロゲルを使用して 24 ウェルプレートデバイスの各マイクロウェルに播種され、再構成されて、ナノ複合マイクロワイヤに物理的に付着した 3D 心臓組織が生成されました。マルチウェルプラットフォームにより、組織形成の一貫性が高く、hiPSC-CM ベースの 3D 心臓組織の収量が増加しました (図 5A)。播種後最初の1週間で、組織は顕著な細胞ゲルの圧縮を受け、最終的に直径が安定しました（図5B-C）。組織の成熟は、週ごとに頻度を増やすという以前に確立されたレジメンを使用して達成されました。電気興奮性パラメータは成熟とともに改善し、電気刺激に対する興奮閾値（ET）の低下と最大捕捉率（MCR）の有意な増加によって示される（図5D-E）。ナノコンポジットマイクロフィラメントの変位をその場で記録することで、活性力、プレテンション、ピーク持続時間など、人工心臓組織の収縮ダイナミクスを非侵襲的に読み取ることができました（図5F-J）。

図5 24ウェルプレートセットアップにおけるhiPSCベースの心臓組織の組み立てと機能

5. 多孔質プラットフォームにおけるナノ複合マイクロワイヤを使用した薬物検査<br /> デバイスの有用性を実証するために、ニフェジピンとリドカインの用量増加に対する組織反応を評価した（図6）。電気刺激下での心臓組織の薬物反応は、当社のプラットフォームで心臓組織内の力とカルシウムの過渡変化を追跡することによって実証できます（図6A）。ニフェジピン曝露により、心臓組織における力とCa2+トランジェントが用量依存的に減少した（図6B）。ニフェジピンの収縮力に対する半最大阻害濃度（IC50）は3.6 nMであり、Ca2+トランジェントに対する半最大阻害濃度は0.8 nMであった（図6C）。同様に、ナトリウムチャネル遮断薬リドカインの適用により、収縮力は用量依存的に減少した（図6D-E）。全体として、これらの結果は、薬物検査のためのナノ複合マイクロワイヤとカーボン電極を備えた新しいマルチウェルプレートデバイスの有用性を検証しています。

図6 24ウェルプレートのセットアップにより、薬物に曝露された心臓組織の収縮力とカルシウムの過渡現象をその場で記録できる。

6. 結論<br /> チップ上での高スループット、信頼性、再現性のある心臓モデルの開発は、創薬や疾患モデリングへの応用に大きな可能性を秘めた、急速に進化している分野です。この研究では、量子ドット/熱可塑性エラストマーナノ複合材料のホットエンボス加工と 3D プリントを組み合わせて使用することで、マルチウェルプレートデバイスフォーマットの自動製造が可能になり、オペレーターを必要とせずに高スループットのデバイス製造が可能になることを実証しています。このフォーマットは、拡張性、標準的な液体処理およびイメージング装置との互換性、複数の組織サンプルを同時に培養する機能の点で、既存の Biowire II デバイスよりも優れています。この自動化されたアプローチは、不活性材料とマルチウェルプレート寸法を使用した高スループットデバイスの製造の難しさを克服し、デバイスの各ウェル内の均一な電界分布により成熟した心臓組織の培養を可能にします。 TPE ベースのアンカーを正確に配置する 3D プリントの汎用性により、さまざまな組織用の他のウェルプレート形式のデバイスの作成が可能になり、さまざまな臓器系にわたる薬剤候補のハイスループットスクリーニングや疾患モデリングのプラットフォームが提供されます。

出典: https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.10.019

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