体内に3Dプリントされた臓器！二重架橋プロセスバイオインク法が「Bioact. Mater.」に掲載されました。

出典: EngineeringForLife

移植組織や臓器の不足は、解決が必要な緊急の臨床問題です。インサイチュー 3D プリント技術により、患者の体内で直接新しい組織や臓器を印刷できます。しかし、このプロセスで使用される印刷インクは結果にとって非常に重要であり、迅速なゲル化、形状の完全性、長期安定性、周囲の健康な組織への接着特性などの特定の要件を満たす必要があります。天然素材の中でもシルクセルロースは優れた特性を持っているため、組織工学や再生医療の分野で広く研究されています。しかし、シルクセルロースは、in-situ 3D プリントの要件を満たすために、さらなる改良が必要です。最近、イタリアのトレント大学のアントネッラ・モッタ教授のチームは、二重架橋シルクタンパク質インクを使用したin-situ 3Dプリントに関する研究を実施しました。研究結果は、1月25日に「二重架橋プロセスを使用したin situ 3D印刷用のシルクフィブロインベースのインク」というタイトルでBioactive Materialsに掲載されました。

この研究では、共有結合架橋プロセス（印刷前の事前光架橋とin situ酵素架橋を含む）を使用して、in situ印刷用のシルクセルロースインクを開発しました。分子量の異なる 2 種類のシルクセルロースの特性が明らかになり、共有結合とせん断力の相乗効果によりシルクの二次構造の β シートへの変換が促進され、急速な安定化が達成されました。新たに開発されたシルクフィブロインハイドロゲルは、優れた機械的特性、長期安定性、酵素分解に対する耐性を備えており、二次構造と膨潤特性は14日間以内の経時変化で大きく変化しません。さらに、in vitro 実験では明らかな組織接着性があることも証明されました。

この記事では、以下の点について詳しく説明します。
1. シルクセルロースインクの開発
2. シルクセルロースインクの特性
3. インビトロ生物学的評価

図 1 二重架橋プロセスの設計とフロー押し出し 3D 印刷技術を使用する場合、インクはせん断減粘性を持ち、押し出し中にフィラメントを形成し、適切な粘度を持っている必要があります。シルクセルロースはこれらのパラメータを満たしていません。設計の最初のステップは、粘度の制限を克服することです。研究者らは、15 mB と 30 mB の 2 種類の異なるシルク分子量と、共有結合を形成する架橋プロセスを選択し、構造、分解、機械的特性をより細かく制御できるようにしました。シルクセルロースを押し出し可能にし、印刷された構造を安定化させるために、プレゲル段階とインサイチュー二次架橋段階からなる二重架橋プロセスが設計されました（図1）。印刷ノズルの押し出し応力によって引き起こされる物理的な架橋により、ランダムコイルからβシート構造への急速な遷移が起こり、ゲルがさらに安定化します。印刷されたゲルは、骨髄間葉系幹細胞の接着と生存をサポートする機械的に安定したシステムを形成し、模擬組織への接着も良好でした。

図 2 印刷可能なインクの粘弾性分析プレゲルは光架橋によって達成されたため、研究者らは TNBS 検出を実行して、メタクリレートと GMA の反応が成功したかどうかを調べ、それによって第一級アミン上のメタクリレート基の置換度 (DS) を定量化しました。結果は、DS が 67% ± 3% であることを示しました。その後、メタクリレートシルクセルロース（Sil-Ma）を光架橋して予備架橋し、不完全な共有結合架橋ゲル（PC）を形成しました。酵素架橋 (EC) は、温度、フリーラジカル、シルク濃度、過酸化物濃度、シルク分子量などの多くの変数に依存するため、前架橋プロセスとして使用される場合に変化します。シルクセルロースのアミノ酸組成を考慮すると、チロシンは全体の約5％を占めており、チロシン内部結合は安定性と弾力性に優れたハイドロゲルを形成できます。二重架橋 (DC) 法が印刷可能かどうかを調査し、酵素架橋 (EC) が完全なゲル化につながるかどうかを検証するために、レオロジー分析を実施しました。印刷性を評価するために、さまざまな組成について粘弾性研究を実施しました。二重架橋（DC）と光架橋前の条件（PC）を比較し、完全に光架橋されたゲル（FC）と完全に酵素架橋されたゲル（EC）を対照として追加しました。すべての条件は粘弾性特性を持ち、G′ は G″ よりも高くなります。 15mB の事前架橋により押し出し可能な均質なフィラメントが生成されましたが、他の条件ではノズルの詰まり、不均一なゲル化 (EC など)、および押し出し圧力の上昇が発生しました。これは主に、30mB Sil-Ma の分子量が 15mB Sil-Ma に比べて低いためです。分子量が低いほど、鎖の絡み合いと長さが少なくなり、それが速度論に影響を与えます。したがって、光架橋効率はシルクの分子量と濃度に依存し、高分子量で調製された Sil-Ma と比較してゲルが弱くなります。しかし、分子量 30 mB ですべての条件で流動点が現れたものの、EC と FC を押し出すために必要な高圧と、繰り返し実験におけるそれらの変化により、架橋前の条件の選択が明確で再現性が高くなり、より均一なフィラメントが生成されました。

図 3 二重架橋プロセス (DC) の印刷パラメータと構造分析粘弾性特性を研究した後、LVE 領域で長期レオロジー試験を実施しました。結果は、事前架橋によって形成されたプレゲルの貯蔵弾性率が低いことを示しました。対照的に、このプレゲルを HRP 架橋 (二重架橋 DC) と組み合わせると、以前の状態と比較して G ′ が大幅に高い均質なハイドロゲルが得られました。すべてのパラメータの中で、ゲル化は主にシルクの分子量と濃度によって影響を受けます。酵素には初期の遅延期があり、その間はゲル化は検出されず、タンパク質は液体のままです。次に、チロシン結合が形成され、続いて鎖間タンパク質架橋が形成されます。時間が経つにつれて、これらの運動プロセスによってさらに重合が進み、チロシン結合が完全に共有結合で形成されます。二重架橋条件（DC）での貯蔵弾性率は72時間以内に増加しました。 PC 条件は時間の経過とともに大きく変化しなかったことから、事前架橋だけでは安定した均質なゲルを形成するのに不十分である一方、二重架橋では適切なゲルを形成できることが確認されました。レオロジー分析の結果、完全に架橋されたゲル（酵素架橋、光硬化架橋、二重架橋ゲル）は押し出すために高圧が必要であり、PC だけでは安定したハイドロゲルを形成できないことが分かりました。2 回目の in situ 酵素架橋は、ポリマー鎖間の共有結合ゲル化をさらに促進するために必要なステップです。したがって、3D プリントを実行する場合、まず事前光架橋を実行し、次に酵素架橋をその場で活性化します。

図 4 ハイドロゲルにおける細胞培養特性の分析図 5 25G ノズルを使用した皮膚表面への二重架橋 Sil-Ma in situ 印刷骨髄間葉系幹細胞をサンプルに接種した後、代謝活性と細胞接着を分析しました。すべての条件において、細胞は 7 日以上生存しました。 1 日目から 7 日目にかけて、細胞代謝活動の大幅な増加が検出されましたが、テストされたさまざまな条件とさまざまな分子量の間には有意な差はありませんでした。マトリックス上の細胞接着の分析を示します。初日には、細胞は互いに相互作用し、細胞クラスターを形成し、いくつかのプロセスを開発する傾向があります。培養7日後、細胞はすべての条件において細長く伸びた形状を示しました。シルクセルロースのアミノ酸組成、および地形、多孔性、刺激、剛性などの要因は、3D 材料上の細胞の挙動にとって非常に重要です。事前架橋（PC）条件と二重架橋（DC）条件では細胞接着と細胞形状に違いが見られなかったことから、細胞と材料の相互作用の駆動力がタンパク質の再配置につながる可能性があることが示唆されました。次に、生体内応用の観点から、押し出されたインクが基材に付着するかどうかを調べるために、二重架橋条件下で皮膚表面に 3D プリントを実施しました。結果は、Sil-Ma インクが基材を反転しても剥がれずに皮膚に付着していることを示しました。シルクセルロースはアミノ酸組成により接着性があり、セリンの極性側鎖は水素結合の形成を通じてマトリックスと相互作用する上で重要な役割を果たします。これらの相互作用は、架橋前の段階での不完全なゲル化に起因するものでもあり、その結果、粘性のあるプレゲルが生成され、その場でゲル化を完了することで組織内で物理的に架橋されます。要約すると、上記の研究結果は、シルクセルロースが 2 つの異なる架橋プロセス (光架橋と酵素架橋を含む) を組み合わせることで、in situ 3D プリントの要件を満たすことができることを示しています。さらに、3D プリント後のハイドロゲルの特性評価により、プリントされた形状をさらに最適化して組織の複雑さをより正確に模倣するための貴重なデータが提供されます。

要約と展望<br /> この論文では、シルクセルロースベースのバイオインクが in situ 3D プリント用に開発されました。このプロセスの汎用性は分子量の異なる 2 種類のシルクセルロースで実証され、製造プロセス (照射時間など) を調整することで in situ 3D プリントが実現しました。さらに、研究者らは、不完全な光架橋による事前ゲル化と HRP 駆動によるその場ゲル化を組み合わせた二重架橋プロセスを開発しました。ハイドロゲルは培地と水の両方で安定した状態を保つことができ、X 型および IV 型プロテアーゼの存在下では 2 週間以内に分解されます。さらに、ノズル内の押し出し応力によって引き起こされる物理的な架橋により、ランダムコイルがβシート構造に急速に変化し、水中や媒体中での膨張プロセス中に安定性が得られます。 PC と DC はどちらも in situ ゲル形成に適していますが、両者の主な違いは、後者における酵素共有結合架橋の相乗効果にあります。一方では、共有結合はシルクの二次構造に影響を与えず、他方では、共有結合によって誘導されたハイドロゲルは、事前に架橋されたハイドロゲルと比較して、プロテアーゼによる分解に対してより耐性があります。これは、シルクセルロースバイオインクの特性が最終用途に応じて調整できることを示しています。使用されるインク濃度はすべて低いですが、共有結合架橋と物理的架橋を組み合わせることで、得られたハイドロゲルは優れた圧縮弾性率と膨潤特性を備えています。これにより製造プロセスが簡素化され、シルクセルロースの濃度調整などの手順が不要になり、ゲル結果の一貫性が向上します。このバイオインクは、将来的に in situ 3D プリンティング研究の進歩をさらに促進するでしょう。

ソース：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.01.015

体内に3Dプリントされた臓器！二重架橋プロセスバイオインク法が「Bioact. Mater.」に掲載されました。

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