超音波で刺激できる3Dプリントの生物学的足場が骨再生を加速

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

細胞培養に物理的刺激を加えると、移動、分化、生存など、さまざまな細胞機能を調節できる可能性があることが示されています。しかし、これらの in vitro モデルを in vivo および in vitro に適用できる実際の可能性は、侵襲的な刺激方法を必要とせずに物理的な刺激を外部から適用できるかどうかによって決まります。この要求に応えて、オランダのマーストリヒト大学技術刺激型再生医療研究所のロレンゾ・モロニ教授のチームは、外部超音波を使用してナノ振動を活性化し、それを周囲の細胞に伝達して細胞機能発現を調節し、骨再生を実現できる3Dプリントの動的両面スキャフォールドを提案しました。関連研究「ナノ振動駆動型骨再生のためのJanus 3Dプリント動的スキャフォールド」は、Nature Communication誌に掲載されました。研究者らは、混合物中の生分解性ポリカプロラクトン（PCL）とポリ乳酸（PLA）の相対的な割合を調整し、相分離によって自発的に両面構造を形成し（図1）、3Dプリント技術を使用して目的のマクロ的な3次元構造を準備しました。PCLとPLAの異なる生体適合性と音響応答性により、それらをそれぞれ裏地材料と活性材料として使用して、超音波トランスデューサー（超音波から機械振動）を形成しました。このようにして、非接触の物理的刺激を感知して伝達し、超音波の周波数をスキャフォールドの機械的たわみ変形に変換し、細胞の増殖、分化、タンパク質発現などの動作に影響を与えます。研究では、超音波によって刺激された足場の表面の細胞は、骨形成マーカーの発現が高まり、マトリックスタンパク質であるI型コラーゲンとフィブロネクチンの沈着が増加するなど、より顕著な骨形成分化を示したことが判明しました。さらに研究者らは、この分化の促進が細胞上の電位依存性カルシウムチャネルの形成促進とさらなる活性化と関連していることを発見した。

図 1 両面構造の 3D プリント準備プロセススキャフォールドを準備する過程で、研究者はまず、広く使用されている生分解性および生体適合性のポリマーであるポリカプロラクトン (PCL) とポリ乳酸 (PLA) を選択し、それらを一定の割合で混合して繊維粒子を作成し、次に溶融堆積 3D プリントによって材料をスキャフォールド構造に押し出しました。 PCL と PLA の間には良好な相互作用がないため、混ざり合わず、2 つの別々の相を形成します。このプロセスは、材料自体の性質により自然に発生する可能性があります。研究者らは、PCL と PLA の相対比率を調整することにより、PCL と PLA を 1:1 の比率で混合すると、印刷された足場構造繊維の内部に明確な相分離界面が見られ、図 1b に示すように、2 つの相をより明確かつ独立して分離できることを発見しました。

研究者らは、印刷された両面構造のスキャフォールドを超音波活性化動的機械スキャフォールドに変換するために、図 2 に示すように、異なる周波数の超音波を選択して、異なるコンポーネント (Janus、PCL、PLA) を含むスキャフォールドの最適なたわみを評価し、細胞反応を引き起こしました。結果は、音波の偏向は音の周波数が高く、材料が柔らかいほど弱まり、PCL は PLA よりも柔らかいことを示しました。これらの材料を個別に分析したところ、偏向振幅が低い（周波数が高い）ほど、刺激を受けていない培養物に比べて増殖率が高くなりました。

図 2 超音波遠隔駆動によるスキャフォールド構造のマイクロナノ振動と細胞挙動への影響骨再生のための 3D プリントスキャフォールドの外部超音波刺激の可能性を評価するために、静的 (0 kHz) および刺激 (40 kHz、30 分/日) 条件下で、Janus、PCL、および PLA スキャフォールド上で hBMSC を骨形成培地で 21 日間培養しました。 21 日間の培養後、刺激を受けた Janus スキャフォールド上に高密度の I 型コラーゲンネットワークが形成されました (図 3a)。一方、刺激を受けた PCL、PLA、または静的培養条件では、細胞内発現のみが示されました。刺激された Janus および PCL 材料で培養された細胞では、刺激された PLA または任意の静的条件と比較して、I 型コラーゲン、RunX2、およびオステオカルシンの上方制御も遺伝子レベルで検出され (図 3b)、上方制御は Janus スキャフォールドでより顕著でした。さらに、Janus スキャフォールド上に堆積した鉱物は、通常は非晶質のハイドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウムである、丸みを帯びた多孔質の形態を示しました。骨の石灰化の過程で、非晶質および球状のリン酸カルシウムが石灰化されて炭酸ハイドロキシアパタイトが形成され、Janus スキャフォールドに骨形成能があることが示されました (図 3d)。機械的刺激下での骨芽細胞反応の重要な調節因子である ATP 放出は、刺激を受けた Janus スキャフォールド上で培養された hBMSC では、他の刺激条件または静的条件下で培養された hBMSC よりも 4 倍高かった。 MC3T3-E1 細胞の骨形成分化中、2D MSC 培養における直接的な低強度超音波刺激により ATP 放出が増加し、細胞膜の脱分極が起こりました。これは、ここでの私たちの観察と一致しています (図 3)。

図 3 Janus スキャフォールドは、遠隔超音波刺激下で hBMSCs の骨形成分化を促進します。機械的刺激の結果として細胞膜の脱分極が起こり、電位依存性カルシウムチャネル (VGCC) が活性化されて細胞へのカルシウム流入が制御されます。 L-VGCC が骨形成分化に関与しているかどうかを判断するために、L-VGCC サブユニット Cav1.2 をコードする CACNA1c 遺伝子の発現を評価しました。その結果、CACNA1c は刺激を受けた Janus スキャフォールドでは 3 倍にアップレギュレーションされましたが、刺激を受けた PCL または PLA スキャフォールドではアップレギュレーションされなかったことがわかりました (図 4a)。分化中、ニフェジピンで L-VGCC を阻害すると、材料条件と培養条件の両方で細胞数の減少が見られましたが、刺激条件下ではより顕著でした。 L-VGCC を阻害すると、I 型コラーゲン、RunX2、およびオステオカルシン遺伝子の発現も低下し、刺激培養条件と静的培養条件の間に有意な差は見られませんでした (図 5d)。したがって、LVGCC がブロックされると、超音波刺激は細胞の分化や増殖に影響を与えなくなり、両者の間に直接的な相関関係があることが実証されました。

要約すると、この研究では、ステントの動的振動を外部から超音波で遠隔制御して細胞の挙動を誘導する方式を提案しました。PCL ステントと PLA ステントは、それぞれ減衰材と偏向材の形で超音波に反応し、これら 2 つの材料を組み合わせると、パルス幅が短くなり、偏向が小さくなります。 Janus スキャフォールドの刺激により、細胞増殖が増加し、hBMSC の骨形成マーカーの発現と沈着も増加しました。したがって、遠隔活性化 Janus スキャフォールドは、細胞にコマンド刺激を提供する従来の静的インプラントの理想的な代替品であり、この研究は、生体内に埋め込まれたときに外部刺激を受け取るための in vitro モデルの応用の可能性を示しています。

ソース：
https://doi.org/10.1038/s41467-021-21325-x

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