糖尿病性創傷治癒を加速するハイドロゲル均一印刷条件の人工知能ハイスループットスクリーニング

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

糖尿病（DM）は世界中でよく見られる病気で、私の国では患者数が最も多く、20歳から79歳の患者が約1億人います。糖尿病患者のうち約 20% は創傷治癒に困難を経験する可能性があります。糖尿病患者の傷が治らない場合は、糖尿病足病変や切断に至る可能性があり、これは糖尿病の高い障害率を引き起こす主な合併症であり、重篤な場合には患者の生命を脅かす可能性があります。創傷治癒には、バリア機能を回復するための複数の因子の協調作用が必要です。糖尿病性創傷治癒の困難を引き起こすメカニズムは複雑で、酸化ストレス、長期の慢性炎症、新生血管の減少、末梢神経障害、細胞外マトリックスの蓄積とリモデリングなどが含まれます。

糖尿病患者の創傷治癒を促進することは、臨床治療において依然として難しい問題です。現在、主な臨床治療対策としては、血糖値のコントロールを基本とした創傷感染の予防と創傷治癒の促進が挙げられます。感染が発生した場合、主な治療法はデブリードマン、ドレッシング、全身抗生物質投与です。成長因子や幹細胞など、新たに研究された治療法の応用は、有効性の証拠が限られており、コストが高いため、遅れています。したがって、理想的な創傷被覆材の開発は、糖尿病患者の創傷治癒を促進する上で重要な進歩であり続けます。

この目的のため、中山大学の周建華教授と黄陸助教授のチームは、ハーバード大学医学部の張于芙科教授のチームと共同で、人工知能支援型ハイスループット印刷条件スクリーニングシステム（AI-HTPCSS）を開発しました。このシステムは、ハイスループット法を使用して、均一なハイドロゲル構造を得るための印刷条件をスクリーニングします。印刷条件を最適化することで、印刷されたスキャフォールドは優れた機械的特性とin vitro生物学的特性を示しました。in vivoとin vitroの両方の実験で、糖尿病性創傷の治癒を加速することが示されました。関連研究は、2022年7月10日に「糖尿病性創傷治癒を加速するためのハイドロゲル構造の印刷条件の人工知能支援ハイスループットスクリーニング」というタイトルで、Advanced Functional Materials誌に掲載されました。

3D バイオプリンティングは、3D バイオプリンターを使用してバイオインクを生成し、足場、バイオニック組織、および人間の臓器を作成する層ごとの製造方法です。組織工学、再生医療、組織モデル工学で優れた用途があります。バイオマテリアルのインクの種類の急速な増加とさまざまなスキャフォールドの複雑化により、従来の印刷条件は適用できなくなる可能性があります。実際、最適な印刷パラメータは通常、3D バイオプリンティングシステムのブランド、外部環境、バイオインクの物理化学的特性など、複数の要因の影響を受けます。したがって、バイオプリンターとバイオインクのより良いマッチングを促進し、印刷品質を向上させるために、印刷条件を迅速にスクリーニングするための効果的な戦略を開発することが、この分野の研究の焦点です。

この問題を解決するために、本研究では人工知能支援型高スループット印刷条件スクリーニングシステム（AI-HTPCSS）を提案した。 AI-HTPCSS は、プログラム可能な空気圧押し出しバイオプリンターと AI 支援画像分析アルゴリズムで構成されています。プログラム可能な空気圧押し出しバイオプリンターは、改良されたガス駆動 3D バイオプリンターと階層型収集基板を備えています。従来の水平面の基板と比較して、傾斜収集基板は 0.57° の角度で傾斜しているため、プリントヘッドを傾斜方向に沿って動かすだけで印刷距離パラメータを連続的に調整でき、精度が向上し、遅延時間が短縮されます。プログラム可能な空気圧押し出しバイオプリンターの助けを借りて、3 つの主要なパラメータ (印刷圧力、ノズルの移動速度、印刷距離) を高スループットで相乗的に調整し、さまざまなパラメータの組み合わせでバイオインクを迅速に堆積させることができます。基板上に堆積されたハイドロゲル画像は、AI 支援画像分析アルゴリズムによってさらに処理され、最適化されたパラメータが出力され、対応するデジタル設計に正確に一致する均一なハイドロゲルスキャフォールドを印刷するためのガイダンスが提供されます。（図1）

図1. AI-HTPCSSを使用した糖尿病性創傷治癒を促進するハイドロゲル構造の印刷条件

1. AI-HTPCSSの構築
AI-HTPCSS は、プログラム可能な空気圧押し出し (バイオ) プリンターと AI 支援画像分析アルゴリズムで構成されています。押し出しバイオプリンターは、傾斜収集基板（図 2B）を備えた改良型ガス駆動 3D バイオプリンター（図 2A）です。水平面を持つ従来の構築プレートと比較して、独自の傾斜プレートは 0.57° の角度で傾斜しています（図 2C）。したがって、傾斜方向に沿ってプリントヘッドを傾斜プレート上で移動させるだけで、印刷距離パラメータ（つまり、ノズルと基板表面の間の距離）を連続的に調整できます。この構成では、距離の変化が連続的になるため、レイテンシが短縮されながら精度が向上します。

最適化されたプリントヘッドは、空気圧でバイオマテリアルインクを押し出し、ビルドプレート上に堆積させるために使用されます。プリントヘッドの移動速度と圧力は、Repetier-Host ソフトウェアによってプログラムされます。プログラム可能な空気圧押し出しバイオプリンターの助けを借りて、3 つの主要なパラメータ (印刷圧力、ノズルの移動速度、印刷距離) が高スループット方式で相乗的に調整され、さまざまな組み合わせでバイオインクが急速に堆積されました。

ハイスループット印刷の後、ビルドプレート上に堆積されたハイドロゲルパターンは、携帯電話で上から簡単に撮影できます。画像は、AI 支援画像分析アルゴリズム (写真からパターン情報を自動的に認識して抽出するように事前にトレーニング済み) によってさらに処理されます。最後に、最適化されたパラメータが出力され、対応するデジタル設計に正確に一致するハイドロゲルスキャフォールドを印刷するためのガイダンスが提供されます。

図2 AI-HTPCSSハードウェア構成

2. AI-HTPCSSを使用して印刷パラメータをフィルタリングする<br /> 3D バイオプリンティング技術では、ゼロ次元 (0D) の液滴と 1 次元の線が、複雑な 2 次元平面または 3 次元の体積スキャフォールドを構築するための構成要素となります。そのため、研究は液滴と線のパターンのスクリーニングから始まりました。 3 つの主要なパラメータ (印刷圧力、ノズルの移動速度、印刷距離) のさまざまな組み合わせで押し出されたアルギン酸ゼラチンインクの液滴と線のパターンを図 3A に示します。結果は、長い印刷距離ではインク滴が形成され、短い印刷距離では通常線が形成されることを示しています。低速（6～8 mm/秒）では線の形状は印刷距離の影響を受けやすいですが、高速（10 mm/秒）では影響が少なくなります。

アルギン酸ゼラチンインクの押し出しパターンに対する印刷パラメータの正確な影響をさらに分析するために、本研究では、新しい人工知能支援画像分析アルゴリズムが開発されました。まず、図3Bに示すように、異なるパターンを含む押し出されたハイドロゲルの画像を94のサブ領域（サブ領域あたり50×50ピクセル、サブ領域あたり10mm×10mm）に分割し、異なるパターンの小さな画像を取得しました。次に、トレーニングされた機械学習ネットワークを使用して、各サブ領域のパターン状態を正確に識別します。同定結果に応じて、モード状態の相図がまとめられました（図3C）。

異なる条件下で印刷された線幅は、ラインごとのスキャン法によって定量化された（図3D（i））。予想されるハイドロゲルライン領域内のピクセル数が計算され、スケーラーに従って幅の値に変換されました。このようにして、異なる印刷パラメータでの線幅が高スループットで得られ、図3D(ii)に状態図として示されています。さらに、線幅分布を示す曲線をプロットし、図3E(i、ii)に示すように変動係数(CV)を計算することによって線の均一性を決定した。結果は、印刷圧力を 30 ～ 40 psi に維持し、ノズルの移動速度を 8 ～ 10 mm/s に維持すると、非常に均一な線が得られることを示しました。最後に、図3E(iii)に示すように、異なる印刷パラメータの下でのライン均一性の程度を示す状態図が得られました。

図3 AI-HTPCSSを使用して印刷パラメータをフィルタリングする

3. 最適化された条件下での 3D ハイドロゲルスキャフォールドの印刷<br /> 上記でスクリーニングした高忠実度のラインを印刷するための最適なパラメータ (図 4A) に基づいて、創傷被覆材用の多層ハイドロゲルスキャフォールドが印刷されました。結果は、最適化された印刷条件下ではより高い均一性が達成され、異なる線間隔またはパターンを持つスキャフォールドは異なる機械的特性を示すことを示しました。印刷されたハイドロゲル足場の圧縮係数と機械的安定性を評価しました。

2.5重量%のアルギン酸ナトリウムと8.0重量%のゼラチンを含むハイドロゲル溶液を使用して、異なる多孔度の足場を印刷しました。異なる多孔度の足場は、異なる機械的特性を示しました。図 4B に示すように、各スキャフォールドは、明確な転移を示すためにピンセットで保持されました。印刷された不均質なハイドロゲル足場は、機械的強度が不均一なため、元のシート状構造を維持できないことが判明しました。スキャフォールドの機械的特性をさらに検証するために、間隔がそれぞれ 0、0.8、1.0、1.2 mm のハイドロゲルスキャフォールドとクモの巣状のスキャフォールドに対して計算シミュレーションを実行しました (図 4C)。結果は、異なる線間隔またはパターンを持つスキャフォールドが異なる機械的特性を示すことを示しました。非均一ブラケットグループの変位が最も大きく、これは実験結果と一致しています。

その後、引張試験を実施し、スキャフォールドの弾性係数を測定した（図4D、E）。図4Eに示すように、間隔が0、0.8、1.0、1.2mmの足場、クモの巣状足場、凹凸状足場の弾性率はそれぞれ0.639、0.278、0.266、0.241、0.461、0.043MPaである。これまでの研究結果によれば、不均質なものを除くすべてのハイドロゲル足場は、皮膚の弾性係数と一致しており、皮膚の傷の治療に適した候補であることが確認されています。最後に、印刷されたハイドロゲル足場の圧縮弾性率と機械的安定性を評価した（図4F）。印刷したばかりの足場と印刷後 7 日間保管した足場に対してテストを実施した結果、線間隔が 0 mm と 0.8 mm の足場は、凹凸構造グループや間隔が 1.0 mm と 1.2 mm の足場よりも圧縮弾性率が高いことが示されました。

これらの結果を総合すると、最適化された条件下で印刷されたハイドロゲルスキャフォールドは安定性が向上したことがわかります。

図4 最適化された印刷条件と最適化されていない印刷条件での多層ハイドロゲル足場の製造

4. 生体内および生体外でのハイドロゲルスキャフォールドの有効性の評価<br /> 印刷されたハイドロゲル足場の細胞適合性を評価するために、ハイドロゲルに浸した培養培地で培養したヒト表皮ケラチノサイト（HaCaT）細胞の生存率を、CCK-8 アッセイと免疫蛍光法を使用して測定しました。異なる濃度のハイドロゲル浸漬培地に曝露されたHaCaT細胞は、24時間で90%を超える高い生存率を示したことがわかった（図5A、B）。上記の結果は、ハイドロゲルの成分が細胞に有害ではない可能性があることを示唆しています。

印刷されたハイドロゲル足場上の細胞の増殖をさらに評価するために、足場とともにインキュベートしたNIH/3T3線維芽細胞の生存率をCCK-8アッセイを使用して測定した（図5C）。スキャフォールドに曝露された線維芽細胞は、3 日目と 5 日目（1 日目と比較）に 100% を超える相対生存率を示し、スキャフォールドが細胞増殖を効果的にサポートできることが示されました。

さらに、印刷されたハイドロゲル足場上の細胞移動挙動をin vitroスクラッチアッセイを用いて調査した（図5E、F）。結果は、細胞の移動の作用により傷が徐々に閉じることを示しました。

図5 印刷されたハイドロゲル足場のin vitro細胞評価

糖尿病性創傷治癒のための印刷ハイドロゲル足場の治療性能を評価するために、生体内実験が実施されました。各糖尿病ラットの背中に全層皮膚欠損を作成し、異なる構造がプリントされたハイドロゲル足場を被せ、異なるドレッシングによる創傷閉鎖プロセスを記録しました。結果は、ハイドロゲルスキャフォールドで覆われた創傷は対照群よりも創傷治癒率が高く、治療を受けていない対照群では 7 日目と 14 日目の両方で炎症レベルが高かったことを示しました (図 6)。

図6 ラットの糖尿病性創傷治癒における印刷ハイドロゲル足場の応用

この研究では、3D 押し出しバイオプリンターとバイオマテリアルインクの特定の組み合わせに対する 3D バイオプリンティングパラメーターの迅速なスクリーニングを行うための新しい AI-HTPCSS を確立することに成功しました。 AI-HTPCSS に基づいて、従来の印刷条件最適化戦略では達成が困難であった、高忠実度ハイドロゲルフィラメントを押し出すための最適化された印刷パラメータ (印刷圧力、移動速度、印刷距離など) を簡単に取得できます。スクリーニングされた最適化条件に基づいて、さまざまな構造を持つ多層グリッドパターンのハイドロゲル足場が糖尿病創傷被覆材として印刷されました。さらに、in vitro および in vivo 実験では、ワイヤ間隔 0.8 mm のスキャフォールドとクモの巣構造がより優れた生物学的特性を示し、糖尿病性創傷の治癒を効果的に促進できることが実証されました。これらの結果は、バイオプリンティング条件のスクリーニングにおけるこの方法の実現可能性を検証し、細胞を含む可能性のある 3D バイオプリント組織工学足場および組織構造の製造を導く上での潜在的な価値を示唆しています。最後に、AI-HTPCSS は (バイオ) 製造プロセスに有用なガイダンスを提供し、3D バイオプリンティング技術のバイオメディカルアプリケーションへの拡張を加速することが期待されています。

ソース：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202201843

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