【分析】骨組織3Dプリント技術の印刷が骨再生の未来の希望となる

この投稿は Little Soft Bear によって 2017-6-19 11:32 に最後に編集されました。

米国における同種骨移植患者におけるヒト免疫不全ウイルス感染率は160万人あたり1人と報告されている。近年、ハイドロキシアパタイトや硫酸カルシウムなどの人工材料が骨欠損部の充填に使用されていますが、実際の効果は自家骨や同種骨に比べて劣っており、骨欠損治療の臨床上の問題を解決するための新しいアプローチと技術が模索されています。 3D プリント技術の台頭により、上記の問題を解決できる可能性が出てきます。

3Dバイオプリンティングは、組織工学における高速プロファイリング技術です。コンピューターの3次元設計モデルを設計図として使用し、レーザー誘導、インクジェット印刷などの技術を使用して、生物学的材料を層ごとに積み重ねて結合し、重ね合わせて成形し、最終的に模擬組織または臓器を形成します。 1999年、ウィンダーらはCTスキャンと頭蓋骨欠損部の形状の3次元再構成を使用し、3Dプリント技術を応用して、患者の頭蓋骨欠損部の治療に適した形状とサイズのチタンインプラントを迅速に印刷し、成功を収めました。井川氏らは、3Dプリント技術を使用してリン酸三カルシウムの骨インプラントを印刷し、犬の頭蓋骨の欠損を修復することに成功しました。骨組織の 3D 印刷には、組織印刷プロセス中に細胞機能の完全性を保護し、印刷後に細胞栄養素の輸送と組織内の老廃物の排出を確実に行うことができる適切なポリマー材料が必要です。 3D 骨モデルの構築方法、自然な骨形成の実現方法、骨治癒の促進方法、細胞生存率の向上方法、免疫原性の低下方法は、骨組織の 3D プリントにおいて解決し、突破する必要がある重要な研究課題となっています。既存の研究作業と進捗に基づいて、理想的な 3D 骨組織印刷のプロトタイプをまとめました。

（１）骨欠損部を原型とし、生体吸収性高分子化合物を材料として用いることで、骨の硬度、多孔性、細胞増殖に適した特性を有する構造足場を迅速に印刷することができる。
（２）細胞はスキャフォールドに付着して増殖し、骨に分化することができる。スキャフォールドの多孔質構造は、酸素や栄養素の供給、骨組織の成長、血管新生を促進し、ストレスシールド効果を回避することができる。
（３）生物学的足場は、血管新生を促進する血管内皮増殖因子や細胞増殖・分化を促進する骨形成タンパク質など、細胞の成長と分化に必要なサイトカインを提供することができ、細胞の骨形成のための継続的な微小環境を提供する。この技術は骨再生に最も効果的な方法であり、完璧な骨の再建と関節の再構築を実現する可能性もあります。

1. 3D プリントされた骨組織バイオスキャフォールド 生物学的スキャフォールドは、3D骨組織印刷の基本的なフレームワークです。印刷が容易で、欠損部に適合し、生体適合性、骨誘導性、機械的安定性、可塑性、生分解性などの特性を備えている必要があります。現在、主な選択肢には、金属、バイオセラミックス、ポリマー、ポリマーとバイオセラミックス、または金属とバイオセラミックスの複合材料が含まれます。

1.1 金属ブラケット チタン合金は軽量かつ強度に優れ、生体適合性にも優れているため、人体に最適なインプラントです。前骨芽細胞をチタン合金スキャフォールド上に移植して培養すると、フィブロネクチン、接着斑タンパク質、細胞数、アルカリホスファターゼ、細胞外マトリックス石灰化結節の増加が検出され、チタン合金スキャフォールドの多孔質構造が前骨芽細胞の接着、増殖、分化、石灰化を促進できることが示されました。我々は、羊の C3-C5 椎骨に多孔質の 3D プリントチタン合金移植片を移植しました。マイクロ CT スキャン再構成と組織染色により、移植片内に大量の骨組織が成長していることが明らかになりました。 3D プリントされた金属ステントは生体適合性が良好で耐圧性も強いものの、金属ステントの印刷は高温条件下で行う必要があり、ステント印刷中に生体活性分子や細胞混合物のコーティングを同時に印刷することはできません。

1.2 バイオセラミックス足場バイオセラミックスは、圧縮抵抗が強く、生体適合性が高く、骨誘導能力が強いなどの利点があり、組織工学研究で広く使用されています。現在、セラミックススキャフォールドには主にリン酸カルシウム、リン酸二ケイ酸カルシウム、二相性リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム/β-リン酸三カルシウムなどの材料が含まれており、その圧縮強度は海綿骨の生体力学的要件を満たすことができます。 3D プリントされたセラミックスキャフォールドは、細胞の骨形成分化と血管新生を促進することができます。ハイドロキシアパタイト足場は歯神経鞘幹細胞の骨形成分化を促進し、二相性リン酸カルシウム足場中のβ-リン酸三カルシウム含有量の増加は細胞の骨形成分化を促進し、ケイ酸カルシウム/β-リン酸三カルシウム足場中のケイ素の放出は骨芽細胞様細胞によるBMP-2およびTGF-βの合成を促進し、骨形成の役割を果たすことができます。 NAGEL スキャフォールドは、ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖と血管新生を促進します。セラミックススキャフォールドは生体適合性、骨誘導能力、圧縮抵抗に優れていますが、高温で印刷する必要があります。印刷中、スキャフォールドに骨形成を促進する生物活性分子や抗感染薬を同時にコーティングすることはできません。同時に、非常に脆く、靭性が低く、せん断応力が弱いという欠点があります。

1.3 ポリマー材料ブラケット 高分子材料は、細胞の骨形成分化、細胞接着、分解の制御を促進するなどの利点があり、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリカプロラクトンなど、組織工学研究にも広く使用されています。ポリカプロラクトンスキャフォールドは骨髄幹細胞とともに印刷されました。in vitro 研究では、細胞内のアルカリホスファターゼ、オステオカルシン、および I 型コラーゲンの発現が増加することがわかりました。組み換えヒト骨形成タンパク質を含むポリカプロラクトンスキャフォールドをウサギの尺骨中骨折部位に移植したところ、骨量の大幅な増加が観察されましたが、スキャフォールドはゆっくりと分解しました。足場の粗さを増やすと、細胞の接着能力が向上します。ポリエチレングリコール分子をRGDとPHSRNで修飾し、骨芽細胞を含む生物学的足場を3Dプリントしてin vitroで培養しました。接着焦点染色により、骨芽細胞の数の増加が観察されました。ポリマースキャフォールドは、新しい骨の形成を増やし、細胞の接着を促進するという大きな利点がありますが、細胞を混合して印刷されたポリマースキャフォールドは圧縮抵抗が弱く、人間の骨の圧縮抵抗要件を満たすことができません。同時に、ポリマー材料の劣化により酸性生成物が生成され、局所的な pH が低下して炎症反応を引き起こします。局所環境 pH の低下は、ポリマー材料中のエステル結合の加水分解を加速し、ポリマー材料の劣化を促進し、ステントの生体力学的効果に影響を与える可能性があります。

1.4 複合材料ブラケット 3D 骨プリントスキャフォールドのニーズをよりよく満たすために、ポリマー材料とセラミック、または金属とセラミックの混合物から作られた複合スキャフォールドが新たなブレークスルーとなりました。骨組織内のコラーゲンとカルシウム塩の有機的な組み合わせなど、セラミックス足場とポリマー足場の利点を組み合わせることで、実際の骨マトリックス環境により近くなり、多くの学者が 3D 骨組織印刷の研究に使用してきました。ポリマー材料とセラミックスで作られた複合材料の圧縮強度は強化され、海綿骨の機械的特性に近くなります。 β-ケイ酸カルシウム/ポリ(乳酸グリコリド)複合スキャフォールドは、in vitro および in vivo の両方の研究において骨形成および組織血管新生を促進する能力があることが示されています。 BMP-2やVEGFなどの生理活性物質を複合スキャフォールドに加えると、スキャフォールド内の血管と骨量の増加をさらに促進することができます。そのため、生理活性分子でコーティングされた複合材料は、3D骨プリントスキャフォールドに最適な選択肢となります。

2. 3Dプリント骨スキャフォールドの多孔質構造と微小環境 臨床現場では、大規模な骨組織移植後の酸素と栄養の供給不足が、移植後の生存率低下の重要な原因の一つとなっています。移植された細胞が利用できる酸素は数時間以内に消費され、局所血管新生によって酸素と栄養素が供給されるまでには数週間かかります。つまり、移植された細胞のほとんどは、十分な酸素と栄養素を得る前に機能を失うか、死んでしまう可能性があります。 3D プリントされた骨組織の多孔質構造は、ストレスシールド効果を排除しながら酸素と栄養素を継続的に供給することができ、その粗い表面形態は細胞接着を促進します。

2.1 孔サイズと多孔度3D プリントされた多孔質組織の孔サイズ、多孔度、および孔の架橋度はすべて、細胞の生存と組織の成長に影響します。久保木らは1998年に、移植片の多孔質構造が骨再生を促進できることを報告した。彼らは、BMP-2を噴霧した固体および多孔質ハイドロキシアパタイトをそれぞれラットに移植し、固体ハイドロキシアパタイトの表面には骨形成が見られなかったが、多孔質ハイドロキシアパタイトの内部には骨形成が見られることを発見した。 2003年、ロイらは、20%のβ-リン酸三カルシウムを付着させた多孔度80%～85%、孔径125～150μmのポリ乳酸多孔質移植片をウサギの頭蓋骨に移植したところ、大量の骨が形成されることを発見した。 Karageorgiou らは 2005 年に、細孔架橋により栄養素の輸送、細胞の移動、細胞架橋、組織の成長能力が向上することを報告しました。

2.2 血管新生 3D プリントされた骨の血管の再生は、体内に移植された後の組織の機能的再構築に影響を与え、3D プリントされた骨組織が臨床的に使用できるかどうかを測る重要な基準でもあります。骨内血管系は、血管から 100 μm 以内の組織に酸素と栄養素を供給することができます。一部の学者は、細胞が埋め込まれた人工骨を体内に移植すると、血管から100～200μm以内の細胞が栄養供給を受けることができることを観察しています。一部の学者は、孔径 523 μm、多孔度 70% のポリカプロラクトン/リン酸カルシウムスキャフォールドを移植した後、骨欠損部位の新しい血管の数が大幅に増加したことも観察しています。他の研究者は、孔径が275μmと400μmの3Dプリントスキャフォールドで多数の新血管を観察したが、スキャフォールドの孔径が100μmの場合には比較的少数の新血管が観察された。したがって、異なる材料の多孔質構造スキャフォールドの孔径と多孔度は、印刷された骨組織における血管新生と新血管成長の深さに密接に関係している。

2.3 骨形成の促進3Dプリントされた骨組織の骨形成分化は、人工骨の品質を測る主な指標であり、多孔質構造は細胞の増殖と分化を助け、骨組織の成長を促進します。ゼラチン共印刷ハイドロキシアパタイト円筒状多孔質スキャフォールドは骨芽細胞の増殖を促進し、生体内研究では、架橋細孔サイズが 100 ～ 400 μm、多孔度が 75% のスキャフォールドが骨芽細胞の増殖と骨形成分化により適していることが判明しています。双方向リン酸カルシウム足場の細孔径が 300 μm の場合、細胞増殖を促進する能力は三リン酸カルシウム足場よりも強力です。現在、学者は皆、多孔質スキャフォールドが骨形成を促進すると考えていますが、骨形成に最も適した孔サイズ、多孔度、架橋度に関する統一基準はなく、これはスキャフォールド材料の違いに関係している可能性があります。

3.3D骨と他の細胞を組み合わせた印刷3D細胞印刷技術は、体外で人工臓器の特定の場所に細胞を定着させ、3次元の多細胞システムを構築する技術です。生物体内の細胞と細胞外マトリックスは、特定の空間構造に配置されています。細胞外マトリックス内の細胞の正確な配置は、生物学的構造、形態、機能の完全性を維持するために必要な条件です。 3D 骨組織印刷では、細胞と足場を同時に印刷するため、足場上での原位置での骨形成が促進され、完璧な骨再生が実現します。現在、3D 骨組織印刷に使用されている細胞には、主に骨芽細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞 (脂肪、骨髄、間葉系)、誘導多能性幹細胞、内皮細胞が含まれます。

3.1 骨芽細胞と内皮細胞の共印刷 骨芽細胞は骨芽細胞に分化する能力を持ち、内皮細胞は血管新生を促進する能力を持っています。骨芽細胞と内皮細胞は 3D 組織に共印刷され、細胞は直接接触、ギャップ結合、オートクリン/パラクリン経路、およびその他の経路を通じて情報を交換し、血管新生と骨組織の形成を促進します。ヒト真皮微小血管内皮細胞とヒト骨肉腫細胞 MG-63 細胞を 3D プリントされた骨組織に移植し、in vitro 培養を行ったところ、多数の微小血管様構造が形成され、VEGF の分泌レベルが増加し、細胞間接着分子の発現がアップレギュレーションされ、MG-63 細胞の生存時間が大幅に増加しました。 HUVECをヒト骨芽細胞とin vitroで共培養すると、VEGF、I型コラーゲン、接着分子の発現が上昇することが検出された。同時に、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、Runx-2などの骨形成マーカーの発現が著しく増加した。しかし、骨形成細胞の数は少なく、増殖能力も比較的低いため、大規模な骨形成には適していなかった。

3.2 成体幹細胞と内皮細胞の共印刷 成体幹細胞は多方向の分化能と骨芽細胞よりも強い増殖能力を持ち、3D骨細胞印刷に使用できます。骨髄間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞を HUVEC と in vitro で共培養すると、微小血管様構造の形成が観察されますが、HUVEC 単独では微小血管様構造を形成できません。一部の学者は、初代骨芽細胞をヒトの内皮細胞と共培養すると、初代骨芽細胞が細胞外マトリックスを生成し、VEGFを分泌することで内皮細胞由来の血管新生を促進することを発見しました。一部の学者は、MSC と HUVEC を in vitro で共培養すると、HUVEC が MSC の増殖と脂肪形成分化を阻害し、HUVEC が MSC の核内の β-カテニンと pSmad1/5/8 の発現をアップレギュレーションして内因性の Wnt および BMP シグナル伝達経路を活性化することで骨形成分化を促進することも発見しました。幹細胞は多能性分化特性を持っていますが、その方向性のある骨形成分化を正確に制御し、血管新生を調整する方法は、この分野でまだ解決されていない重要な科学的課題のままです。

3.3 胚性幹細胞の印刷 胚性幹細胞は、体外培養において無制限に増殖し、自己複製し、多方向に分化するという特徴があり、骨形成を容易に誘導できるため、多くの学者によって3D骨組織印刷に使用されています。ヒト胚性幹細胞を培養して胚を形成し、間葉系幹細胞を取り出してアルギン酸粒子でコーティングした炭酸カルシウムの足場に移植したところ、細胞によるアルカリホスファターゼとオステオカルシンの発現が増加し、カルシウム塩の沈着が顕著になりました。 RGD 修飾 CPC スキャフォールドにヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞を移植すると、骨形成が大幅に刺激されます。胚性幹細胞は骨分化能に優れているものの、腫瘍化率は依然として避けられず、コストが極めて高く、倫理的な問題もあります。

3.4 iPSC 細胞印刷iPSC 細胞は、遺伝子導入技術によって特定の転写遺伝子を体細胞に導入することによって生成され、体細胞を胚性幹細胞のような多能性細胞に直接再構築することができます。医療用途における胚性幹細胞の免疫拒絶と倫理的ジレンマのため、学者たちは胚性幹細胞の代わりにiPSC細胞を使用しようとしています。マウスの尾の線維芽細胞をiPSC細胞に再構築しました。形質転換成長因子β1と形質転換成長因子β2で処理した後、iPSC細胞におけるRunX-2、OSX、OPN、OCN遺伝子の発現レベルが増加しました。細胞をハイドロキシアパタイト/炭酸三カルシウムの足場に移植し、生体内研究でiPSC細胞におけるオステオカルシンの発現が増加することがわかりました。 iPSC細胞を血漿処理したポリエーテルスルホン足場に移植すると、アルカリホスファターゼとオステオカルシンの発現が著しく増加しました。ラットに移植すると、骨欠損部位に大量の新しい骨が形成され、治癒が速いことがわかりました。ヒト骨髄中のCD34+細胞にpEB-C5ウイルスを導入し、iPSC細胞に再構築し、培養してリン酸カルシウム足場に移植しました。iPSC細胞の生存期間は長く、ALP、RunX-2、I型コラーゲンなどの骨形成遺伝子の発現レベルが大幅に増加し、骨塩合成が増加したことがわかりました。 BMP-2遺伝子を含むレンチウイルスをiPSC-MSCに導入し、炭酸カルシウムの足場に移植したところ、細胞の骨形成分化と骨塩の形成が著しく促進されました。ウイルスの導入により細胞に「再プログラム」遺伝子を追加したり、欠陥のある遺伝子を置き換えたりする方法は、感染を引き起こしたり、細胞腫瘍を作ったりする可能性がありますが、iPSC技術は胚細胞や卵子を使用しないため、倫理的な問題はありません。同時に、iPSC細胞は患者の体細胞から調製されるため、免疫拒絶の問題がなく、調製できる細胞の数も十分です。

4. 3Dプリント骨組織と生分解体内に埋め込まれた3Dプリント骨組織は、骨欠損部位の機能再建を促進します。骨機能再建の過程で、細胞は新しいマトリックスを生成して足場を置き換え、最終的に骨組織欠損前の生理学的状態に達します。材料の分解にとって理想的な状況は、新しいマトリックスと材料の分解速度が時間と空間で同期できることであり、印刷された組織材料の分解は骨の局所的な生体力学に影響を与えません。 Wangらは、β-CS/PDLGA複合スキャフォールドをウサギに移植した場合、新骨形成は4、12、26週でそれぞれ16.33%、28.7%、26.37%であり、スキャフォールドの分解率は4週と20週でそれぞれ33.71%と65.72%であったことを発見しました。これは、β-CS/PDLGAスキャフォールドが骨誘導効果を持ち、骨形成を促進するだけでなく、スキャフォールドの分解率が新骨形成率に近いことを示しています。王らは、β-リン酸三カルシウムの優れた骨伝導性とβ-CSの優れた骨誘導性を備えたハイブリッド多孔質バイオセラミックススキャフォールドを作製し、大腿骨欠損部に移植した。彼らは、β-リン酸三カルシウムとβ-CSの比率が1：1のとき、4、12、26週目の新骨形成量はそれぞれ19.54％、30.00％、23.55％であり、対応するスキャフォールドの分解率はそれぞれ19.48％、52.36％、66.81％であることを発見した。つまり、スキャフォールドの分解は新骨形成とほぼ同期している。このように、骨組織の形成とスキャフォールドの分解は時間的にも空間的にもほぼ同期しており、局所的な骨組織欠損のより迅速な治癒を促進することができる。

研究が深まるにつれ、骨移植における骨組織 3D プリントの可能性はますます多くの学者の注目を集めています。既存の研究では、骨組織 3D プリントが栄養と酸素の供給、生体力学、細胞の骨形成分化、足場の分解において重要な役割を果たすことがわかっています。骨組織の 3D プリントは、骨腫瘍切除後の骨組織移植など、整形外科において非常に幅広い応用が期待されています。北京大学第三病院は、環軸椎悪性腫瘍の治療のため、3Dプリント技術を用いて軸椎を人工的にカスタマイズする世界初の手術を完了した。インプラントはチタン合金粉末で3Dプリントされた軸椎であり、3Dプリント技術が臨床脊椎手術に応用されたことを示すものである。上記の研究における骨組織 3D プリントの利点と研究者のさらなる努力と探求に基づくと、骨組織 3D プリントは骨再生の未来となるでしょう。

編集者: Antarctic Bear 著者: Zheng Yang、Li Weishi、Liu Zhongjun (北京大学第三病院整形外科)

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