3Dプリントされたマイクロニードルアレイパッチは、小分子、タンパク質、核酸の液体固体皮内送達に使用できます。

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

マイクロニードルアレイパッチ (MAP) は、1970 年代から、低侵襲性の薬物送達および診断のための有望なプラットフォームとなっています。伝統的に、MAP はポリマーの裏地上に均等に分散されたマイクロメートルスケールの針の配列で構成されています。これらのマイクロニードルは、角質層を貫通し、神経に到達することなく皮膚の表皮と真皮に進入できるため、痛みのない皮内（ID）治療を実現します。最近、スタンフォード大学の Joseph M. DeSimone チームとノースカロライナ大学の Jillian L. Perry チームは、高解像度の 3D プリントを使用して、新しい格子 MAP (L-MAP) 構造を準備しました。従来の成型および固体コーティングされた MAP と比較して、L-MAP はパッチあたりの針の数を減らしてより多くの貨物を積載できるため、貨物の積載および薬剤送達能力が向上します。さらに、L-MAP は、関連する治療貨物 (小分子、タンパク質、核酸) を液体および固体で送達するためのプラットフォーム技術になる可能性があります。

関連する研究結果は、2024年9月2日に「調整可能で多用途な皮内送達のための3Dプリント格子状マイクロニードルアレイパッチ」というタイトルでAdvanced Materialsに掲載されました。

1. グリッドマイクロニードルアレイパッチ（L-MAP）ライブラリのシステム設計 L-MAPを設計するために、針の基部形状（三角形、正方形、五角形、六角形、円）、針の格子層の数（1、2、3）、支柱のテーパースケール（図1A）などの変数を体系的に変化させました。テーパスケールとは、図1Aに示すように、各支持支柱の基部から先端までのテーパの度合いを指し、テーパスケールが大きいほど、最小支柱幅と最大支柱幅の差が大きくなります。これら 3 つの主要変数の組み合わせを使用して、さまざまな L-MAP 設計グループが生成されました。この設計戦略を使用して、43のL-MAP設計が生成され、コンピュータ支援設計（CAD）ファイルから空隙容量とストラット表面積が計算されました（図1B）。この戦略は、さまざまな針表面積と空隙容積を調査し、異なる貨物放出速度を持つ設計を分離するために使用されました。

機械的完全性 (MI) スコアを設計するために、予測される最大フォンミーゼス応力 (GPa) と先端の変形を最小限に抑えながら、高い安全係数 (> 6) を持つ針の体積の割合を最大化しました。開発された MI スコアリングシステムは、5 サンプル L-MAP 設計を使用して検証され、MI スコアに基づいて圧縮強度が経験的に評価されました。 3つのL-MAP設計ではMIスコアが10を超えましたが、他の設計ではMIスコアが1桁低かったです（図1C）。ライブラリ設計とコンピュータシミュレーションのデータに基づいて、図 1D に概説されているワークフローに従って下流の特性評価に最適な L-MAP 設計が選択され、四角いベースのソリッドニードル MAP と比較されました。

図1 L-MAP設計ライブラリの生成
2. L-MAP設計の製造と機械的特性 次に著者らは、選択した 3 つの L-MAP 設計を、Carbon 3D が開発した工業用高解像度 CLIP プロトタイププリンターでの印刷用に最適化しました。この研究では、各パッチの L-MAP を 10 分以内に印刷することに成功し (印刷サイズ = 5 mm × 8.2 mm × 2 mm)、針の形態とトポロジーを示すために針の SEM 画像を撮影しました (図 2B)。パッチあたり 40 本の針を備えた L-MAP 設計をインストロン装置で圧縮テストし、破損力と破損モードを評価しました (図 2C)。すべての針は折れるのではなく、曲がることで故障します。これは、針の破片が使用者の皮膚に残る危険を回避するのに最適です。これらの破壊力はすべて針1本あたり約0.1Nを超えており、これは皮膚を貫通するために必要な平均力です（図2D）。切除したヒト皮膚におけるL-MAPの浸透深度を光干渉断層撮影（OCT）を用いて評価した（図2E）。全体的に、3 つの L-MAP 設計は、固体 MAP と比較して、人間の皮膚での平均浸透深度が高くなることが示されました (図 2Eii)。
図2 最適なL-MAP設計の3Dプリントと機械的特性
3. L-MAP の固体および液体小分子送達 このプラットフォームが小分子の固体および液体送達に有用であることを実証するために、著者らはメチレンブルー染料をモデル貨物として選択しました。固体貨物を積載する場合、パッチは 0.5 wt/v% のメチレンブルー染料と粘度/安定性を高める賦形剤 (メチルセルロースとスクロース) の混合物に浸漬コーティングされます。ディップコーティング後、パッチを室温で1時間風乾した（図3Ai）。一般的に、L-MAP は、同様のサイズのソリッド MAP と比較して、貨物積載容量が少なくとも 2 倍増加しており、Sq 2 Tier L-MAP 設計では最も多くの貨物を収容できます (図 3Aii)。 MAP ディップコートの数を増やすことで、固体貨物の積載量を増やすこともできます。さらに、L-MAP 設計の貨物積載は、3 回目のディップコーティング後に定常状態に達しました。したがって、その後の固体貨物送達特性評価のために、すべての MAP はパッチごとに 3 回ディップコーティングされました。液体送達については、同様のディップコーティング戦略を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.5wt/v％メチレンブルー染料をパッチに充填し、充填された液体染料の量を定量化した（図3B）。光学顕微鏡画像からわかるように、L-MAP は空隙に液体貨物の液滴を捕捉できましたが、固体 MAP は液体製剤を捕捉できませんでした (図 3Bi)。

各 L-MAP 設計の小分子染料送達動態は、水分を補給した切除した豚の皮膚で評価されました。パッチには 0.5 wt/v% のメチレンブルー染料 (固体または液体) が充填され、指定された適用時間の間、豚の耳の皮膚生検に塗布されました。パッチを除去した後、皮膚に送達された染料の量は、パッチ上に残っている貨物の割合として取得されました。この方法は、固体状態（図 3C）と液体状態（図 3D）の両方における小分子製剤の貨物送達速度論を評価するために使用されました。液体貨物の配送を考慮すると、固体 MAP では液体貨物を効果的に捕捉できないため、L-MAP の放出プロファイルのみが評価されました。予想通り、固体送達の放出動態は液体送達の放出動態とは異なっていました（図3C、D）。固体貨物の配送の場合、Pent 2 Tier と Sq 3 Tier の設計は同様の放出速度を示し、貨物の 45% が 5 分以内に放出されます。 Sq 2 Tier 設計では、貨物の放出ペースが若干遅く、5 分以内に配達された貨物はわずか 38% でした。最後に、固体 MAP が最も速く貨物をリリースし、貨物の 56% が 5 分以内に配達されました。

さらに、著者らは、液体貨物の放出動態は L-MAP 設計によって異なり、Sq 2 Tier パッチが最も速く、最も効率的な貨物送達を提供することを観察しました。貨物の85%以上が適用時間から5分以内に配達されました（図3D）。総合すると、上記のデータは、LMAP が、異なる放出プロファイルを持つ固体および液体の小分子ペイロードを皮膚に効果的に送達するために使用できることを示しています。

図3 固体および液体の小分子染料送達の速度論
4. L-MAP を使用した固体オボアルブミン (OVA) の送達 タンパク質抗原送達はワクチン分野で大きな注目を集めており、卵白アルブミン (OVA) は MAP 送達を介したタンパク質抗原およびタンパク質治療薬の有望な代替手段であることが実証されています。そのため、著者らは、L-MAP を介して調整可能な放出速度を実証した、以前に報告された固体 OVA タンパク質製剤を使用することを選択しました (図 4A-B)。異なる放出プロファイルを示すために、異なる蛍光体 (Texas Red および AlexaFluor 488) で標識された OVA タンパク質が選択されました。まず、パッチあたり 1 本の針の設計 (Sq 2 Tier または Pent 2 Tier) を使用した L-MAP の放出プロファイルを、切除した豚の皮膚で評価しました。 SEM および蛍光顕微鏡を使用して、分離された Texas Red 標識 OVA の Sq 2 層針への充填と、AlexaFluor 488 標識 OVA の Pent 2 層針への充填を確認しました (図 4C)。個々のパッチで観察された傾向は ex vivo のブタ皮膚でも確認され、混合 L-MAP では Sq 2 Tier ジオメトリが Pent 2 Tier ジオメトリよりも速く貨物を放出しました (図 4Di)。パッチを除去した後、テープで皮膚を剥がし、L-MAP 展開中に皮膚表面に堆積した貨物の量を定量化しました。再び、皮膚表面に沈着した貨物の量は最小限（<4％）であり、時点間で有意差がないことが観察されました（図4Dii）。これらの結果は、組織を切片化して各蛍光体タグ付き OVA タンパク質の蛍光信号の深さを視覚化することでさらに検証されました。

異なる放出動態を検証した後、混合L-MAPをラットに10分、30分、1時間、または4時間適用した（図4Ei）。一般的に、蛍光シグナルは最大24時間持続し、パッチ除去後48時間でシグナルの大部分は消失した（図4Eiii）。混合L-MAPのSq 2層画分も、Pent 2層画分と比較してより短時間でより高い割合のOVAカーゴを放出し、ex vivo豚皮膚で観察された結果をさらに裏付けました（図4Di）。上記のデータは、混合 L-MAP が同じタイプの貨物の異なる放出プロファイルを実現できること、および L-MAP システムを使用して固体 OVA タンパク質を送達できることを示しています。

図4 L-MAP OVAタンパク質送達は異なる放出速度を示す
5. L-MAP を使用した液体 mRNA 送達 COVID mRNAワクチンの発売に伴い、液体mRNAワクチンもワクチン投与の分野で注目を集めています。体内での皮内液送達における L-MAP プラットフォームの有用性を実証するために、治療に関連するモデル貨物として、D-Lin MC3 脂質ナノ粒子 (LNP) にカプセル化されたホタルルシフェラーゼ (FLuc) mRNA を選択しました。 Sq 2 Tier設計は、高い空隙率と液体送達の迅速な放出特性のため、RNA送達に選択されました（図3D）。 40ピンSq 2 Tier L-MAPは、パッチあたり約850 ngのFLuc mRNAをロードでき、ピンあたり20 ngをロードできます（図5A）。このRNA負荷容量は、従来の可溶性MAPシステムやコーティングMAPシステムと同等ですが、パッチあたりの針の数はおよそ半分になります（図5B）。

再現性のある RNA 送達とトランスフェクションを実証するために、著者らは ex vivo のブタ皮膚モデルを使用して、Sq 2 Tier L-MAP が貨物を送達し、局所的な細胞トランスフェクションを誘発できることを実証しました。 FLuc タンパク質の発現は、適用後わずか 1 分以内に観察されました (図 5Ci)。さらに、0.4 μg と 0.8 μg の 2 種類の mRNA を投与したところ、L-MAP の用量依存性が示されました。パッチの適用時間の長さに関係なく、高用量RNAから観察された発光シグナルは、低用量RNAから観察された発光シグナルよりも一貫して高かった（図5Cii）。これは、投与量は、単に充填溶液中の貨物の濃度を変えることによって制御できることを示唆しています。その後、FLuc mRNA LNP は L-MAP を介して生きた動物に注入されました。液体mRNA LNPを充填したL-MAPをラットに5分間または1時間塗布し、空のパッチを陰性対照として使用した（図5Di）。パッチ上に残っているRNAを評価すると、塗布後わずか5分以内に、充填された液体貨物の約50％が放出されたことが判明しました（図5Dii）。より長い適用時間（1 時間）で、商品の 75% が輸送されました。既存のRNA MAPシステムと比較すると、送達効率は約2倍高くなります。

さらに、液体FLuc mRNA送達を使用したすべてのSq 2 Tier L-MAPで、堅牢なトランスフェクションとタンパク質発現が観察されました（図5Diii）。発光シグナルはパッチ除去後3時間で早くも観察され、L-MAP除去後24時間でピークに達し、72時間で弱まり、典型的なmRNA組織トランスフェクション特性を示しました（図5Div）。これらの結果は、ラットにおける L-MAP 液体 RNA の効率的かつ再現可能な送達が、強力なタンパク質発現をもたらすことを示しています。

図 5 Sq 2 層 L-MAP は液体 RNA カーゴを搬送し、細胞をトランスフェクトできます。この研究では、高解像度プリンターを使用して、L-MAP の汎用性と調整可能性を拡張し、多数の固体および液体カーゴを搬送しました。テーパードストラットを使用して設計された新しい L-MAP 構造により、格子針内の機械的完全性を維持しながら、より大きな空隙容量を維持できます。さらに、L-MAP は、関連する治療貨物 (小分子、タンパク質、核酸) を液体および固体で送達するためのプラットフォーム技術になる可能性があります。この研究は、特に複数の薬剤を皮内空間に送達する薬剤送達を拡大する可能性を秘めています。 L-MAP プラットフォームによって導入されたモジュール性により、さまざまなペイロードに対する薬剤送達オプションが広がります。ただし、装着時間を短くしてより高い送達効率を確保するには潜在的な制限があります。私たちは、迅速かつ効率的な投与計画を実現できるデバイス設計要素を組み込むことで、今後の研究で L-MAP の治療効果を実証するためにこの研究を拡大したいと考えています。

ソース：

https://doi.org/10.1002/adma.202404606

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