T 細胞製造のためのバイオハイブリッドハイドロゲルのスケールアップ戦略としての 3D プリント

出典: EngineeringForLife

細胞免疫療法の出現により、がん、自己免疫疾患、感染症と闘うためのより効果的な戦略がもたらされました。しかし、これらの治療に関連する細胞製造プロセスは依然として高価で時間がかかり、その適用範囲が制限されています。最近、リンパ節にヒントを得た PEG-ヘパリンハイドロゲルが、実験室規模での一次ヒト T 細胞培養を改善することが示されました。

臨床応用をさらに促進するため、スペインのバルセロナ自治大学 (UAB) の材料研究研究所 (ICMAB-CSIC) の Judith Guasch 氏とそのチームは、その拡張性を評価し、3D プリントによってそれを実現することに成功しました。このようにして、バイオハイブリッド PEG-ヘパリンハイドロゲルにおける初代ヒト T 細胞の浸潤能力を高め、栄養素、老廃物、ガスの輸送を増加させ、それによって初代ヒト T 細胞の表現型を維持しながら増殖率を高めることができました。したがって、この記事は、細胞免疫療法で使用される細胞製品の製造の改善の要件を満たすための一歩を踏み出します。関連研究は、2024年9月16日にACS Applied Materials & Interfaces誌に「T細胞製造のためのバイオハイブリッドハイドロゲルのスケールアップ戦略としての3Dプリンティング」と題する論文として掲載されました。

1. 革新的な研究内容
3D プリンティングでは、レイヤーごとのアプローチを通じて、正確に設計された形状を持つ複雑な 3D オブジェクトを自動的に製造できます。さまざまな種類の 3D 印刷技術の中でも、押し出しベースの印刷は、材料をノズルから押し出し、それをフィラメントの形でプラットフォーム上に堆積させて 3D 構造を形成するだけなので、バイオメディカル分野で特に人気があります。人工リンパ節の製造を一歩前進させ、大量の治療用 T 細胞の製造に関連する現在の ACT の制限を克服するために、以前に説明した PEG-ヘパリンハイドロゲルを 3D プリントのインクとして分析し、ヒト T 細胞培養に使用しました (図 1)。

図1 細胞培養用の3Dプリントハイドロゲルを使用した自己T細胞製品の製造の簡略図
3DプリントインクとしてのPEG-ヘパリンハイドロゲル

細胞の生存と増殖を最大限に高めるために、栄養素、ガス、老廃物の交換を最適化するために 3D スキャフォールド設計が選択されました。この設計により、ハイドロゲルの固有のマイクロメートル規模の多孔性が維持され、その有効性は以前に実証されています。さらに、新しい材料の評価に一般的に使用され、線間隔が 1.5 mm の 4 層のグリッドで構成されるシンプルなデザインが選択されました (図 2A)。そのシンプルさは、翻訳の可能性と技術移転の選択肢にも貢献します。この目的のために、PEG-ヘパリンハイドロゲルを事前に形成し、室温でさまざまなハイドロゲル形成時間で 3D 印刷用のインクとしてテストしました。 2 つの成分を 4 時間混合した後、4 アーム PEG チオールとマレイミド機能化ヘパリンのサンプルは、印刷に十分な粘度に達しました (図 2B)。しかし、結果として得られたスキャフォールドは一貫性が低く、印刷されたグリッド内の線の分化が不十分でした。品質を向上させるために、予め形成されたハイドロゲルを混合後12時間後に使用し、本論文の目的に適した足場が得られました（図2C）。最後に、潜在的な細胞負荷実験のために PEG-ヘパリンハイドロゲルを細胞培養培地に溶解する可能性を評価しました。この場合、おそらく二価イオンの数が少ないためにジスルフィド結合の形成が促進され、ハイドロゲル形成に利用できるチオールが減少したため、ハイドロゲルの形成が直ちに起こりました。興味深いことに、得られた材料は簡単に印刷できます (図 2D)。

図2 PEG-ヘパリンハイドロゲルの3Dプリントを最適化するために設計された足場の概略図
[CD4+ T細胞増殖のためのPEG-ヘパリンインプリントスキャフォールド]
PEG-ヘパリンハイドロゲルの印刷可能性が実証されると、3D 層状構造が印刷され、初代ヒト CD4+ T 細胞の培養用の 3D スキャフォールドとして評価されました。出発点として、約 35 マイクログラムと 50 マイクログラムの材料を使用して、それぞれ 4 層または 6 層からなるステントが、各ライン間の間隔が 1.5 ミリメートルで製造されました。次に、一次ヒト CD4+ T 細胞を 106 個/ml の濃度で播種し、6 日間培養しました。次に、サンプルとコントロール（懸濁培養細胞）の増殖、複製、拡大指数をフローサイトメトリー（32）で取得し、比較した（図3A-C参照）。

次のステップでは、接種後 5 日目に両方のタイプの 3D プリントハイドロゲルから生成された T 細胞の表現型を分析しました。具体的には、細胞はナイーブ型（TN; CD45RO-/CD62L+）、中心記憶型（TCM; CD45RO+/CD62L+）、エフェクター型（TEFF; CD45RO-/CD62L-）、エフェクター記憶型（TEM; CD45RO+/CD62L-）に分類されました。 4 層ハイドロゲル (図 3D) では、TCM 表現型の割合が大幅に増加し、TEM が減少したことが観察されました。具体的には、4 層プリントハイドロゲルの TCM 値の中央値は 66%、陽性コントロールは 61%、陰性コントロールは 45% でした。さらに、印刷されたスキャフォールドの TEM 平均は 23% であったのに対し、陽性対照では 30%、陰性対照では 14% でした。最後に、TN 細胞は不活性化細胞では 39% でしたが、懸濁液またはハイドロゲルを使用して培養した細胞では 5% と 6% に大幅に減少しました。ただし、活性化細胞間では有意差は得られませんでした。 6層スキャフォールドでも同様の傾向が見られましたが、特にTCM表現型では、観察された違いはそれほど顕著ではありませんでした（図3E）。

図 3. 高さ 4 層または 6 層のプリント PEG-ヘパリンハイドロゲルおよび懸濁培養 (陽性対照) で 6 日間培養した一次ヒト CD4+ T 細胞の正規化された増殖結果。
【3Dプリント技術によるハイドロゲルの大型化】

最近の研究では、PEG-ヘパリンハイドロゲルの使用により、増殖や分化を含む免疫細胞の培養を改善できることが実証されており、これはACTなどの細胞療法にとって興味深い結果です。しかし、これらの治療法には数リットルに達する培養量が必要ですが、現在の結果は 1 ml 未満の量で達成されました。したがって、ハイドロゲルの臨床応用を実現するためには、ハイドロゲルのサイズを拡大する必要がある。しかし、足場のサイズが大きくなると、細胞、栄養素、ガスの送達が確実に困難になります。この問題を解決するために、本論文では 3D プリント技術を使用してステントのサイズを拡張する方法を研究しています。そこで本論文では、より大きな直径（25G）の針を選択し、その印刷性を従来の針と比較しました。どちらの場合も、予め形成された PEG-ヘパリンハイドロゲルを針を通して押し出し、セグメントを印刷することによって連続繊維が得られました (図 4A、B)。予想通り、より大きな針を使用すると繊維の直径が大幅に増加しました (図 4C)。

図 4 空気中で押し出されたハイドロゲルと 27G および 25G の針で印刷された繊維の代表的な画像。さらに、拡散比も 1.68 ± 0.35 (27G) から 2.49 ± 0.41 (25G) に増加しました。これは、どちらの場合も 1 ～ 3 の間であるため許容範囲内です。（33）さらに、各層の線間隔が1.5mmで、交互に垂直に配置された10層からなる円形グリッド構造を設計することによって構造を修正した（図5A）。この新しいデザインにより、印刷物の量を 10 倍に増やすことができます。新しい設計をさらに特徴付けるために、X 線マイクロコンピュータ断層撮影と環境走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して、印刷されたハイドロゲルの細孔サイズと相互接続性を測定しました (図 5B、C)。画像に示されているように、層状構造と、以前にバルクハイドロゲルで観察されたハイドロゲルの内部構造が確認できます。

図 5 直径 1 cm のスキャフォールドのサイズと使用される材料の量を最大化するように設計された 3D プリントハイドロゲルの概略図と写真画像。さらに、スキャフォールドの機械的特性はレオロジーによって測定され (図 S3)、印刷されていない材料の機械的特性と比較されました。印刷されたハイドロゲルの貯蔵弾性率（G′）は447 ± 34 Paであったのに対し、印刷されていないハイドロゲルの貯蔵弾性率（G′）は1.1 ± 0.1 kPaであった。予想通り、印刷されたハイドロゲルは、バルクハイドロゲル内の同じ材料と比較すると、印刷時に剛性がいくらか失われました。しかし、両方のハイドロゲルタイプの機械的特性は同等であり、印刷されたハイドロゲルは材料内部への細胞のアクセス性が向上し、バルクハイドロゲルと比較してこの材料の使用を拡大する機会がより多く提供されます。最後に、大規模な 3D プリントハイドロゲルを使用して、初代ヒト CD4+ T 細胞を培養しました (図 6)。印刷された構造の利点を判断するために、結果を同じ質量の印刷されていないハイドロゲル (バルク構造) と比較しました。

図6 播種後6日目の懸濁液（陽性対照）、バルク非印刷PEGヘパリンハイドロゲル（10x NP）、バルク3D印刷PEGヘパリンハイドロゲル（10x 3D P）で培養した一次ヒトCD4 + T細胞の正規化された増殖結果
2. まとめと展望

この論文では、PEG-ヘパリンハイドロゲルを 3D プリントしてうまく作成できることが実証されており、細胞を含んだ構造物を含む数多くの潜在的な用途への扉が開かれています。さらに、印刷されたスキャフォールドで培養された一次ヒト CD4+ T 細胞の増殖は、懸濁培養と比較して促進され、6 層スキャフォールドの増殖率は 4 層スキャフォールドよりも高かった。さらに、これらの 3D プリントハイドロゲルは、免疫療法の高い有効性に関連する表現型である TCM 細胞の割合を 5 日目に増加させました。最後に、PEG-ヘパリン実験室用ハイドロゲルの拡張性を評価し、ACT に必要な免疫細胞を培養するための 3D スキャフォールドとして使用できる可能性を評価するために、大規模な 3D プリントハイドロゲルが製造されました。これらの実験では、3D プリントされたハイドロゲルは、最先端の懸濁法やモノリシックハイドロゲルと比較して、より高い増殖率を達成しました。これらの結果は、モノリシックハイドロゲルと比較して、3D プリントハイドロゲルの内部への細胞、老廃物、栄養素、ガスの輸送が強化されたことで説明できます。このように、材料の利点と 3D 印刷技術の利点を組み合わせることで、臨床的に有用な PEG-ヘパリンハイドロゲルが得られる可能性があることを実証しました。

ソース：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.4c06183

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