湖南大学のハン・シャオシャオ率いる研究グループ：新しい光散乱抑制メカニズムにより、高忠実度光硬化性生物3Dプリントが可能に

出典: MF High Precision

光硬化型生物学的 3D 印刷技術 (デジタル光処理、DLP など) は、空間内の細胞と生体材料の分布を正確に制御して、複雑な幾何学的構造を構築できます。組織工学、薬物スクリーニング、外科用インプラントなどの生物医学研究分野で広く使用されています。しかし、DLP印刷プロセスでは、固体と液体の界面で光が物理的に散乱します。細胞の混合によりこの散乱効果が悪化し、ハイドロゲルが目的外の領域で固化して印刷精度が低下し、優れた生物学的特性と小規模な特徴（血管網や薄壁構造など）を備えた多くの複雑な構造を形成することが困難になり、DLP印刷技術のバイオメディカル分野への応用が制限されます。この課題に応えて、湖南大学機械交通工学部の韓暁暁教授らは、光吸収とフリーラジカル反応の相乗効果によって光散乱を抑制する新しいメカニズムを提案し、このメカニズムに基づいて新しい光阻害剤（クルクミン-Na、Cur-Na）を開発しました。これにより、細胞を含んだハイドロゲルの光硬化印刷中の光散乱効果が低減し、印刷精度が1.2～2.1ピクセルに向上し、幾何学的誤差が5％未満に低減しました。彼らは、マルチスケールチャネルと薄壁ネットワーク構造を備えたさまざまな生物活性機能性スキャフォールドの製造に成功しました。さらに、この方法では印刷パラメータのウィンドウが広く、パラメータの最適化プロセスが大幅に短縮されます。関連する研究結果は、「高忠実度光ベースバイオプリンティングのための同時光吸収とフリーラジカル反応による光阻害」と題する論文で Nature Communications (SCI Zone 1、トップジャーナル、IF=17.69) に掲載されました。湖南大学博士課程の何寧氏が筆頭著者であり、湖南大学機械交通工学部の韓暁暁教授と陳鋒准教授が責任著者である。

ハイドロゲルバイオインクの従来の光吸収剤は、余分な光エネルギーを吸収し、印刷層が厚くなりすぎないようにすることで、垂直方向の印刷精度をある程度向上させることができます。しかし、従来の光吸収剤では、光散乱による水平方向の過剰硬化の問題を解決することが困難でした。そこで本研究では、光吸収とフリーラジカル反応の相乗効果による光抑制メカニズムを提案した。従来の光吸収剤の機能を保持しながら、水平方向の散乱光によって励起されたフリーラジカルを「奪い取り」、散乱領域でのフリーラジカルとハイドロゲルの重合反応を抑制し、非対象領域の凝固を防ぎ、水平方向の印刷精度と忠実度を向上させる。このメカニズムに基づいて、研究チームは初めて、水溶性と生体適合性に優れた新しいタイプの光阻害剤（Cur-Na）（図1）の開発に成功しました。次に、研究チームはさまざまな光阻害剤を含む PEG-GelMA バイオインクを調製し、バイオインクの物理化学的性質を研究することで、印刷性と機械的特性を評価しました (図 2)。その後、重合プロセスの理論的および実験的研究を通じて、Cur-Na が散乱効果を緩和するメカニズムが明らかになりました (図 3 を参照)。Cur-Na の吸収ピークは 425 nm 付近にあり、これは光源の波長に非常に近いため、光の浸透深度を減らす典型的な光吸収剤として機能します。同時に、Cur-Na はより高い反応速度でフリーラジカルを競合的に奪取し、ハイドロゲルモノマーの重合を防ぎ、固化したハイドロゲルを形成します。さらに、Cur-Na の反応生成物は液体であるため、対象領域以外の部分の凝固を回避できます。 Cur-Na の反応率が高いため、Cur-Na の濃度を一定に保つことで、広範囲の光強度における散乱効果を抑制でき、異なる構造を印刷するときに印刷パラメータを再度最適化する必要がなくなり、印刷効率が向上します。論文では、図 4 と 5 で、Cur-Na を添加した後のバイオインクの印刷解像度とパターン忠実度を定量的に調べ、光散乱効果を解決するための Cur-Na の有効性を検証しています。その後、研究チームは、Cur-Naを添加したバイオインクをBMF精密microArch S140光硬化プリンターに適用し、さまざまな複雑な構造（バイオニックスキャフォールド、灌流可能な血管ネットワーク、最小限の3周期表面など）を製造することに成功し、小規模な特徴を持つ機能的な細胞を含んだ3次元スキャフォールドを製造する際の光阻害剤の優れた能力を実証しました（図6を参照）。図 7 は、このバイオインクの組織工学への応用可能性をさらに示しています。

図1. クルクミンナトリウムの合成。 a. クルクミンと重炭酸ナトリウムからクルクミンナトリウム（Cur-Na）を合成するプロセス。クルクミン分子中のフェノール性水酸基の H+ は Na+ に置き換えられ (赤い楕円)、クルクミン中のカルボニル結合はケト-エノール互変異性化を起こします (青い楕円)。 b. クルクミンとCur-Naの1H-NMRスペクトル。合成中に起こる化学的性質の代表的な変化を示しています。青色の網掛け部分はフェノール性水酸基の特性共鳴（δ = 9.65 ppm）を示しています。緑色の部分はオレフィン信号（δ = 5.93 ppm）であり、C=C 二重結合の形成を示しています。
図2. バイオインクの物理化学的特性。異なる濃度の光阻害剤を添加したバイオインク (PEG-GelMA/LAP) の貯蔵弾性率 (G' は材料の剛性を反映) と損失弾性率 (G'' は材料の粘度を反映) の経時変化: a. タートラジン、b. Cur-Na。 G′とG′の交点はゲル化点と呼ばれ、ゲル化時間は暴露開始からゲル化点までの時間（本研究では約20秒）として定義されます。バイオインクは405 nm、13 mW cm−2の光に30秒間さらされました。網掛け部分は露出時間を示します。 c. ハイドロゲルの応力-ひずみ曲線。 d. 3 つのハイドロゲルの約 20% のひずみにおける弾性率。 e. 膨潤率と f. 3 つのバイオインクのゾル分率の比較。
図3. Cur-Naによる散乱効果抑制のメカニズム。 a. 光がバイオインクを透過したときの光強度のガウス分布と、散乱なしのバイオインク、散乱ありのバイオインク、細胞と混合したバイオインク、Cur-Na を添加したバイオインクなど、さまざまな条件下での結果として生じた固化領域を示す概略図。 Cd と Cw はそれぞれ硬化深さと硬化幅です。 E0 はバイオインク表面の光強度を表し、EC は重合を開始するために必要な臨界エネルギーです。 b. Cur-Naフリーラジカル連鎖成長重合の速度論は、（1）開始、（2）連鎖伝播、（3）（4）終了の3段階で制御されます。 ki、kp、ktc、ktd はそれぞれ 4 つの反応における速度定数です。各 Cur-Na は 3 つのフリーラジカル (R·) と反応してポリマー鎖の成長を開始し、モノマー (M) を形成します。活性化されたモノマーは他のモノマーと反応し、ポリマー鎖が増殖して Mn· および Mm· を形成します。連鎖成長が停止反応によって停止すると、ポリマー（Mn および Mm）が形成されます。 c. Cur-NaとPEGDAの重合中の官能基の変換率と時間の関係。散乱領域内のフリーラジカルは Cur-Na によってすぐに消費されますが、散乱領域ではフリーラジカルが不足しているため、ハイドロゲルモノマーはポリマーを形成するのが困難です。
図4. 水平方向の印刷精度の分析。 a. スポーク状のパターンは、印刷精度を評価するために使用され、隣接するスポーク間の隙間は中心から周辺に向かって増加します。印刷精度は、ぼかし領域（赤い破線の円）の直径とスポーク状のパターンの直径の比として定義されます。 b. 細胞を含んだ構造の蛍光染色。 c. 印刷された構造の顕微鏡画像。ぼやけた領域 (赤い破線の円) のサイズと、純粋な PEG-GelMA バイオインク (上) およびタートラジン (中央) と Cur-Na (下) が添加されたバイオインクの相対露光エネルギーの関係を示しています。 Er は相対エネルギーを指し、実際の光エネルギーと単位露出の比率として定義されます。 d. ぼやけた領域のサイズと露光エネルギーの間の定量的な関係。 e. Cur-Na の高精度印刷ウィンドウ。灰色、赤色、青色の領域は、それぞれ 1 mM、2 mM、3 mM Cur-Na を含むバイオインクの印刷ウィンドウの幅を表します。 f. 細胞を充填した印刷構造のぼやけた領域のサイズと露光エネルギーの間の定量的な関係。
図 5. 多層印刷における中空チャネルの印刷可能性分析と高忠実度を評価するための印刷エラー分析。 a. 異なる直径（D = 300、500、700 μm）のチャネルを備えたシリンダーの 3D CAD 設計。 H はシリンダーの高さを表し、h1、h2、h3 はチャネルの中空部分を表します。印刷精度は、中空部分とチャネルの全長の比率として定義されます。 b. 連続層印刷における散乱効果と、その結果生じる過硬化現象。 ce. シリンダー直径およびチャネル直径の高さと印刷精度の関係。 f. 異なる直径を持つマルチチャネル構造の CAD 設計。 g. それぞれCur-Naとレモンイエローを含むバイオインクを使用して印刷されたサンプル。 h. チャネルの実際の直径と設計直径の差。
図 6. バイオメディカル用途で一般的に使用される複雑な 3D 構造を印刷する際の Cur-Na の解像度と高い忠実度。 a. 脊髄ステント。その構造的特徴は、脊髄の内部構造を模倣した、不規則なチャネルネットワークと薄い壁を呈しています。 2 種類のハイドロゲル、PEG-GelMA (10%) とグリシジルメタクリレート修飾シルクフィブロイン (Sil-MA (15%)) を使用してスキャフォールドを正常に作成しました。 b. 複数の枝、灌流可能なチャネル（200～800 μm）、薄い壁（約100 μm）を持つ血管ネットワーク。着色染料溶液を注入して灌流を行った。 c. ユニークなトポロジー特性（曲面、高多孔性、接続性）を備えたジャイロイドスキャフォールド。 d. HepG2細胞を搭載したジャイロイドスキャフォールドを印刷し、14日間培養したところ、良好な細胞増殖効果が示されました。
図 7. PC-12 細胞の in vitro 培養に基づく Cur-Na の細胞適合性評価。 a. 細胞の生死染色蛍光画像は、14 日後の細胞の生存率を示しています (緑: 生細胞、赤: 死細胞)。 b. CCK-8 は細胞増殖を測定するために使用されました。細胞はスキャフォールド内で 14 日間増殖し、PEG-GelMA/Cur-Na ハイドロゲル内の細胞が最も優れた増殖効果を示しました。 c. 均一な細胞分布を示す、PEG-GelMA/Cur-Na ハイドロゲルを使用して作製されたチャネルスキャフォールド (直径 200 μm) の蛍光画像。最後の画像は、チャネルに沿った細胞の成長を示しています。 d. 1日目、7日目、14日目の脊髄スキャフォールド内のチャネルの共焦点画像。 e. PEG-GelMA/Cur-Na スキャフォールドの表面に播種された PC-12 細胞の分化と神経突起形成を示す蛍光画像 (7 日目)。 Tuj-1: ベータ3-チューブリン; DAPI: 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。
結論この研究では、光吸収とフリーラジカル反応の相乗効果による新しい光抑制メカニズムを提案し、光支援 3D プリンティングにおける光散乱効果を効果的に抑制しました。このメカニズムに基づいて、次の独自の利点を持つ新しい光阻害剤（Cur-Na）が開発されました：（1）印刷解像度と忠実度が大幅に向上：ハイドロゲルの膨潤を制限する条件下では、印刷精度をプリンターの理論上の限界（約1ピクセル）に近づけることができます。（2）印刷パラメータへの適応性が優れているため、印刷パラメータの最適化プロセスが大幅に簡素化されます。（3）マイクロスケールのチャネルと薄い壁を備えた複雑なスキャフォールド構造を製造する優れた能力があり、スキャフォールド内の栄養素の輸送と酸素の浸透に非常に重要です。（4）光散乱効果に特に敏感な細胞を充填したジャイロイドスキャフォールドを正常に製造でき、14日間の培養後、スキャフォールド内の細胞は良好な増殖傾向を示しました。（５）この方法は、フリーラジカル連鎖成長重合によって制御される他の光硬化性インク（例えば、Sil-MAなど）にも適用できる。この研究で提供された、組織構造にマルチスケールの特徴を直接与える方法は、自然組織の微小環境をより適切にシミュレートするために非常に重要です。この研究で確立された戦略により、生物学的 3D 印刷における高忠実度の複雑な構造の印刷性と操作性が向上し、より高度な組織工学および再生医療アプリケーションの実現が容易になります。

オリジナルリンク: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38838-2

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