バイオプリントされた神経膠芽腫モデルは細胞外マトリックスの機械的特性の不均一性を模倣する

出典: Saifo Biotechnology

神経膠芽腫 (GBM) は最も致死率の高い原発性脳腫瘍であり、細胞および分子の高度異質性、血管過形成、および固有の薬剤耐性を特徴とします。細胞成分と細胞外マトリックス (ECM) は、GBM における不均一性の 2 つの主な原因です。ここで、カリフォルニア大学サンディエゴ校の Tariq M. Rana 氏と Shaochen Chen 氏のグループの Min Tang 氏を含む著者らは、腫瘍領域、無細胞 ECM 領域、内皮領域を備えた生体模倣の 3 ゾーン GBM モデルを開発しました。このモデルでは、GBM マトリックス、病的または正常な脳実質、および脳毛細血管に対応する領域剛性を備えています。 DLP 光硬化型 3D バイオプリンティング技術の柔軟性と多様な材料選択により、腫瘍モデルの生物物理学的および生化学的特性の直交変調が可能になります。

患者由来の GBM 細胞、ヒト内皮細胞、ヒアルロン酸誘導体を使用して、ヒト化微小環境を確立しました。この in vitro 研究では、生物物理学的シグナルがさまざまな腫瘍細胞の挙動と血管新生能に関与し、腫瘍細胞のさまざまな分子サブタイプへの変換を制御していることが実証されています。強皮症モデルの転写発現は間葉系サブタイプのものと類似しており、腫瘍細胞の拡散浸潤とテモゾロミドに対する耐性の増加が見られ、一方、内皮細胞は血管新生の芽生えを示しました。軟部組織モデルでは、古典的なサブタイプ関連経路が豊富に見られ、腫瘍細胞は拡大した細胞増殖を示しました。この研究では、フォトステレオリソグラフィー 3D バイオプリンティング技術を使用して、生物物理学的異質性を備えた迅速で柔軟かつ再現性の高い患者固有の GBM モデルを実現しました。このモデルは、将来の研究で GBM の疾患メカニズムを研究し、薬剤をスクリーニングするための制御可能なシステムとして使用できます。

地域ごとに異なる生体物理学的特性を持つ 3D バイオプリント GBM モデル<br /> 空間的に不均一な ECM 微小環境を再現し、ECM の不均一性が GBM の発達と内皮細胞の成長にどのように影響するかを調べるために、著者らは DLP 3D バイオプリンティングシステムと、GMHA や GelMA などの脳腫瘍特有の ECM 由来のバイオインクを使用して、純粋な腫瘍ハードモデル、純粋な腫瘍ソフトモデル、共培養ハードモデル、共培養ソフトモデルの 4 つの異なるモデルを作成しました (図 1A)。共培養モデルでは、ヒト臍帯血管内皮細胞 (HUVEC) を使用して、腫瘍および ECM 領域を囲む内皮領域を印刷しました (図 1B)。 ECM 領域については、著者らは GBM 組織の硬さと健康な脳の硬さを模倣するために 2 つの異なる硬さを設計しました (図 1C)。さらに著者らは、さまざまな機械的特性を持つこれらの 3D プリント GBM モデルを使用して、遺伝子発現、薬物反応、腫瘍細胞の移動挙動、血管新生活性などの生物物理学的シグナルと培養条件を評価しました。（図1E）。

図1. 3DバイオプリントGBMモデルは、地域ごとに異なる生体物理学的特性を持っています
3D モデルは、スフェロイド培養と比較して転写シグネチャが異なります<br /> 主成分分析の結果、スフェロイド培養はいずれの 3D 培養と比較しても異なる転写プロファイルを示したが、2 つの 3D 培養間の違いはそれほど大きくないことが明らかになりました (図 2A)。いくつかのタンパク質をコードする癌関連遺伝子または予後遺伝子は、両方の 3D 培養条件で 16 倍以上アップレギュレーションされました (図 2B、C)。スフェロイドと比較して、3D軟組織モデルではDNA複製、細胞周期調節、細胞分裂に関連する経路が著しく豊富でした（図2D）。

図2. GBMスフェロイド培養と3Dモデル間の異なる転写プロファイル
スクレロチンモデルはGBMの低酸素状態と腫瘍形成の特徴を促進する

強皮症モデルでは、低酸素症、癌の浸潤性、E-カドヘリンの喪失による転移、インターフェロン、炎症、ECM、アポトーシスなどの外部刺激に対する反応に関連する遺伝子セットが有意に増加していました（図3A、B）。強皮症モデルでは、低酸素関連遺伝子、ならびに低酸素関連血管新生マーカーVEGFAおよびSPP1の発現が上昇していた（図3C）。免疫蛍光（IF）染色により、軟部組織モデルにはより多くの KI67 陽性細胞が存在することが示されました（図 3D）。

3Dモデルは異なるGBM侵入パターンと転写サブタイプを誘導する
ソフトモデルにおけるTS576細胞とCW468細胞の浸潤面積は、それぞれハードモデルの7倍と4.4倍であった（図3F）。硬いモデルから分離された TS576 細胞は、柔らかいモデルから分離された TS576 細胞と比較して、一次 GBM 組織の特徴が非常に豊富であり (図 3G)、硬いモデルが細胞をより臨床的に関連のある状態に変換することを示唆しています。
図3. 生物物理学的パターン形成はGBM細胞において異なる転写プロファイルと浸潤パターンを誘導する
内皮細胞は 3D プリントされたモデルで異なる成長パターンと血管新生を示します<br /> スクレロチンモデルでは、遊走したCD31+HUVECは芽のような血管新生形態を示し、SOX2+GBM細胞と密接に接触していた（図4A）。血管新生マーカーSPP1とVEGFAはすべての3Dモデルでアップレギュレーションされ、硬質モデルまたは共培養モデルで有意に増加しました（図4B）。

GBM と内皮細胞のコミュニケーションが腫瘍の浸潤と薬剤耐性を高める<br /> 腫瘍細胞は、柔らかい共培養モデルでは線維芽細胞のような形態で増殖したのに対し、硬いモデルではより丸い形態で増殖した（図4C）。スフェロイドで培養された細胞と比較して、すべての 3D バイオプリントモデル内の腫瘍細胞は TMZ に対する耐性が強化されていました (図 4D)。 qPCR分析により、ABCG2やCXCL12などの耐性関連遺伝子は、硬い共培養条件下でそれぞれ8倍と24倍にアップレギュレーションされ、TMZ処理に対する反応と一致していることが示されました（図4E）。

図4. 硬いモデルは内皮細胞の血管新生を誘導し、GBM細胞の薬剤耐性を高める
結論この研究では、腫瘍領域と内皮領域が元の状態に近い硬さを持つように設計されました。特別に設計された ECM 領域の 2 つの剛性条件が腫瘍領域と内皮領域の間に印刷され、GBM 再構築マトリックスまたは健康な脳実質の剛性を模倣し、異なる腫瘍細胞の増殖と挙動を誘発しました。ソフトモデルでは細胞が急速に増殖し拡大しましたが、ハードモデルでは悪性表現型に関連する低酸素、幹細胞性、血管新生能力が強化されました。

腫瘍細胞は、2 つの硬度微小環境において、異なる形態とパターンで ECM 領域に侵入しました。ハードモデルは単一細胞の拡散侵入パターンを示し、ソフトモデルは拡大成長パターンを示しました。 GBM 細胞では両方の侵入モードが観察されており、剛性変化モデルが GBM 発達のさまざまな状態をモデル化するのに適している可能性があることを示唆しています。遺伝子セットエンリッチメント解析により、2 つの剛性が異なる GBM サブタイプのモデル化に適していることが示されました。

血管新生は、腫瘍の成長を促進し、腫瘍の浸潤を容易にする GBM の特徴的な特徴です。遺伝子発現により、スクレロチンモデルの腫瘍細胞は、スクレロチンモデルで観察された発芽表現型と一致して、より高いレベルの血管新生マーカーを発現していることが明らかになりました。ソフトモデルは細胞増殖を促進し、腫瘍細胞の浸潤領域の増加と内皮細胞の増殖として現れました。

すべてのモデルおよび球状培養コントロールに対する TMZ 処理の結果、硬い共培養モデルで腫瘍細胞の生存率が最も高かったことが示され、硬い条件と内皮細胞との共培養によって GBM の薬剤耐性が強化されることが示唆されました。

本研究で提案された GBM モデルの 3 ゾーン剛性パターンは、GBM の生理学的に関連する生物物理学的異質性と生化学的に関連する ECM 材料を組み合わせた初めてのモデルです。局所的な硬直により、本来の環境がよりよく再現され、より生体模倣的な細胞-ECM および細胞相互作用が促進される可能性があります。これらのモデルは将来、GBM のさまざまなサブタイプやさまざまな段階の GBM を研究するために使用される可能性があります。剛性の変化は、他の腫瘍-間質相互作用に対する生体物理学的影響を研究するための将来のモデルにも適用される可能性があります。

オリジナル記事: https://doi.org/10.1002/smll.202006050

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