3D多孔質生物足場印刷用のマイクロ流体バブルジェネレーターとデジタル光処理プラットフォーム（DLP）

出典: バイオプリンティングと再生工学

3D プリントされた多孔質スキャフォールドの多孔質特性により、スキャフォールドは細胞の増殖、拡散、移動、および細胞分化を促進し、栄養素の輸送や細胞代謝物の除去の効率も向上します。しかし、一般的に使用されている犠牲マイクロスフェア法では、犠牲材料を溶解する複数のステップが必要であり、時間がかかり柔軟性に欠け、また、細孔サイズの柔軟な制御性にも制限があります。マイクロ流体チップは、よりシンプルに、より速く、より制御可能な方法で多孔質構造を生成できます。上記の理由から、マイクロ流体の原理に基づいて多孔質構造を製造するための新しい技術を開発する研究がますます増えています。

近年、一部の研究者はマイクロ流体チップと押し出しプリンターを組み合わせています。この方法は操作が簡単ですが、複雑な内部構造と外部形状を持つ体積構造を製造する場合には非効率的であることが多いです。張宇洛科教授のチームは、迅速な架橋の利点を持つバルブベースのフローフォーカス（vFF）チップと3Dデジタル光処理（DLP）印刷プラットフォームを選択し、この複合技術により、生成される孔のサイズ、2Dおよび3D印刷の複雑さ、およびスキャフォールドの生体適合性に関して、天然の多孔質組織の模倣特性が向上することが期待されることを確認しました。

図1 本研究で使用した主なコンポーネント (A) VFFチップ (B) DLPプラットフォーム
1. 界面活性剤の選択 界面活性剤は、空気と液体の界面の表面張力を低下させ、気泡の崩壊や凝集を防ぎ、一貫した印刷品質と材料特性を保証します。そこで研究チームはまず、3種類の界面活性剤（ラムノリピド、CTAB、レシチン）が泡の安定性に与える影響をテストしました。結果は、ラムノリピッドの泡安定性が 0.5% (w/v) および 5% (w/v) の濃度で最も悪くなることを示しました。対照的に、CTAB は 5% (w/v) の濃度ではレシチンよりも優れた安定化効果を示しましたが、0.5% (w/v) ではその逆の結果となりました。この実験で使用する界面活性剤としてレシチンが選択されたのは、低濃度で安定化効果があり、さらに潜在的な細胞毒性を低減し、ほとんどの場合に十分な印刷時間である 5 分以内に最高のパフォーマンスを発揮するためです。その後、チームは濃度勾配実験（0%、0.5%、1%、3%、または5%（w/v））を実施し、最終的に1%濃度のレシチンを界面活性剤として選択しました。

2. 気泡サイズを制御するためのVFFチップのパラメータ設定に関する研究
VFFチップの構造は下図の通りで、バルブチャンネルの作動圧力を変えることでオリフィス幅を制御できます。この研究では、研究チームは、インク流量、ガス入力圧力 (Pg)、バルブ作動圧力 (Pv) の 3 つの要素を変更することで、VFF チップによって生成される気泡のサイズ範囲を調査しました。
図 2 VFF チップのチャネル図まず、チームはバルブ作動圧力 (Pv) とオリフィス幅の機能的関係を調査しました。結果は、両者が逆S字型の関数関係に従うことを示しています。大気圧下では、オリフィスの幅は約100μmです。 2.3 bar の圧力では、細孔は完全に閉じ、2.5 bar を超える圧力では破損しました。

次に、研究チームはPvを大気圧に制御し、インクの流量とガス入力圧力（Pg）が気泡生成に与える影響を調査しました。結果は、ガス注入圧力とインク流量のさまざまな組み合わせを使用して、均一な直径、小さな標準偏差、および 211μm から 747μm の範囲で調整可能なサイズの泡を生成できることを示しています。

その後、研究チームはバルブ駆動圧力Pvを変更し、生成される気泡のサイズをさらに小さくすることを試み、平均で約211μmという前述の下限値を突破しました。結果は、気泡サイズが圧力 Pv の増加とともに非線形関係で減少し、最小気泡サイズが 143μm であることを示しています。同時に、チームは3つのパラメータのさまざまな組み合わせをテストし、さまざまな条件下での泡生成の堅牢性を実証することにも成功しました。

上記の実験結果は、vFF チップ内の生成プロセス中に気泡のサイズを制御できること、および異なるプロセスパラメータによる変動範囲が 143μm から 747μm であることを証明しています。
図3 VFFチップの異なるパラメータにおける開口状態と気泡サイズ
3. 2Dプリントの実現可能性検証 光開始剤は化学架橋を引き起こす可能性があり、2D および 3D 印刷可能性を実現するための重要な試薬です。そこで研究チームは、LAP（フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスホネート）（0.2%、0.4%、1%（w/v））の濃度勾配実験を実施し、最終的に1% LAPをさらなる実験に選択しました。405 nmの光の下で15秒未満の露光時間で、強力で再現性のある架橋を実現できます。

チームは、共通のプロセスパラメータセットを使用して、さまざまな複雑さの形状を印刷しました。インク配合 7.5% (w/v) fGelMA、1% (w/v) レシチン、1% (w/v) LAP、流量 = 650 μL min-1、pg = 1.3 bar、pv = 大気圧。実験結果は、プロセスパラメータを形状に応じて最適化する必要がなく、印刷時間は構造自体の複雑さとは無関係であることを示しています。

その後、研究チームは明視野顕微鏡を使用して、2D プリントによって気泡の直径を正確に調整できることを捉え、実証しました。一定体積流量 50 μL min-1、Pg 100～250 mbar、pv 0～2.25 bar を使用して、平均直径 112 ± 7、198 ± 7、239 ± 19、361 ± 17、424 ± 17 μm の気泡を 2D プリントし、ヒストグラムをプロットしました。これらの実験で vFF チップを使用して生成された気泡の平均最大直径は 424 μm であったのに対し、vFF チップ内の最大の気泡の平均直径は 747 μm であったことに留意する必要があります。研究チームは、これはチップの外側の気泡がチップの高さによって圧縮されなくなり、直径が縮小した三次元の円になったためだと考えている。さらに、大きな気泡はチップの外側の大気圧にさらされると安定性が低下する傾向があり、それがある程度、気泡の破裂につながる。

最後に、チームは 3D グラデーション印刷のニーズをよりよく満たすために 2D バブルグラデーション印刷の機能をテストしました。チームは、vFF チップに直接適用できる高速デジタル制御を使用したため、中断することなく連続的にバブルを印刷することができました。大きな気泡は、流量 50 μL min-1、pg = 250 mbar、pv = 大気圧で生成されました。中程度の気泡は、圧力を pg = 100 mbar に下げて生成されました。小さな気泡は、vFF チップのオリフィスを縮小するために、圧力 pv をさらに 2.25 bar に上げて生成されました。インクを架橋した後、研究チームは極めて均一な丸い泡を観察し、そのほとんどは六角形のパッキングで整列していました。

要約すると、チームの研究結果は、このデバイスが複雑な幾何学的構造を印刷し、パラメータを変更することなくその中に制御可能なサイズの泡を生成できることを証明しています。同時に、グラデーション連続印刷機能も備えています。
図4
4. 3Dプリントの実現可能性検証 チームはトップダウン DLP プリンターを使用して、ますます複雑になる形状を 3D プリントすることができました。また、印刷された構造は、細胞培養培地に 14 日間浸漬した後でも明らかな変形がなく、構造的完全性を維持できることも検証されました。同時に、研究チームは、印刷された構造物の空間解像度の低さや表面の凹凸など、いくつかの欠陥も指摘した。

その後、研究チームは、ローダミン結合fGelMAを用いた共焦点蛍光顕微鏡を用いて多孔質構造の空間構造を調べた。分析の結果、細孔は最も近い六角形のパターンで配置されており、生成された細孔のほとんどはすでに 3D 配置で相互接続されていることがわかりました。その後、研究チームは、小、中、大の孔サイズを持つサンプルのμCT再構成を実行しました。これらの構造は、共焦点蛍光顕微鏡の結果と比較して、多孔性が低下していることが示されました。研究チームはまた、3D印刷中に表面張力や印刷プロセス中のその他の操作によって欠陥が形成され、フォームインク内に不完全に密集した気泡が生じる可能性があるという推測も示しました。一方、μCT スキャン用のサンプル準備中の取り扱いにより、構造が外力の影響を受ける可能性があります。

要約すると、研究チームは、3D プリントには多少の欠陥があるものの、結果として得られる多孔質構造は正確に調整可能であることを実証しました。 3D DLP 印刷方式では、均一性に優れた孔サイズ、実現可能な直径の範囲が広く、より制御可能で高速なプロセスを実現できます。
表1 3Dプリントの最終パラメータの概要図5 3Dプリント可能性を検証するためのプリント構造
5. 細胞適合性試験 組織工学や再生医療への応用に関しては、3D プリントされた多孔質ハイドロゲル構造と播種された細胞との細胞適合性が組織の置換にとって重要です。これを基に、研究チームはさまざまな染色法を用いて細胞の生存率、増殖、移動、拡散に関する定性的な研究を実施しました。

まず、細胞を 3D プリントされた多孔質構造内で 14 日間培養し、1、3、7、10、14 日目に生死アッセイと F-アクチン/核染色を実施しました。研究チームは、14日間の培養期間を通じて、死細胞の割合が低いことを観察したほか、培養プロセス中に細胞がクラスター状に凝集する状態から、広がって足場の大部分を占める状態に変化したことも発見した。上記の実験に基づいて、研究チームは、この足場が優れた生体適合性を備えていることを証明しました。

図6 スキャフォールド細胞適合性の実験的試験
概要 この実験では、トップダウン DLP プリンターとバルブベースのフローフォーカシング (vFF) チップを組み合わせ、堅牢な印刷プロセスを確立し、細胞染色分析を使用して細胞適合性テストを実施しました。その結果、多孔質構造により、14 日以内に細胞の成長、拡散、増殖、移動をサポートできることが示されました。 fGelMA は、その物理化学的特性により、DLP 印刷用のインク材料として好まれています。材料の選択では、7.5％（w/v）のfGelMA水溶液、界面活性剤として1％（w/v）のレシチン、および光開始剤として1％（w/v）のLAP濃度が選択されました。同時に、研究チームはインクの流量、ガス圧、バルブのサイズを調整することで、気泡のサイズを制御することに成功しました。現在の研究では、均一な直径は最大 747 ミクロンから最小 143 ミクロンまでの範囲であることが示されています。全体として、この実験により、ハイドロゲルマトリックス内に調整可能なサイズの均一な気泡を生成し、細胞に適合する多孔質の足場を製造することに成功しました。

参考文献
（フィリップ・ウェーバー、リン・カイ他 2023）

Philipp Weber、Ling Cai、Francisco Javier Aguilar Rojas、Carlos Ezio Garciamendez-Mijares 他「マイクロ流体バブルジェネレーターにより、多孔質構造のデジタル光処理 3D プリントが可能に」、Aggregate、2023 年。

https://doi.org/10.1002/agt2.409

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