ハーバード大学医学部科学：3D プリントを使用して石灰化大動脈弁疾患を治療する

出典: EngineeringForLife

石灰化大動脈弁疾患 (CAVD) は、弁の線維性肥厚、それに続く弁尖石灰化、弁狭窄、そして最終的には心不全と死を特徴とする、活動性で細胞主導型の進行性疾患です。薬物介入の開発のための分子基盤を確立するのに役立つ適切な実験モデルが不足していることも一因となり、現在、有効な薬物は存在しません。大動脈弁 (AV) の弁尖は、細胞外マトリックス (ECM) で構成される 3 つの異なる層、すなわちコラーゲンが豊富な線維層、プロテオグリカンが豊富な海綿状層、およびエラスチンが豊富な心室層によって定義されます。弁間質細胞 (VIC) は AV で最も一般的な細胞タイプです。生理学的条件下では、VIC は増殖と組織の再構築を通じて弁の恒常性を維持する静止状態の線維芽細胞様細胞です。しかし、病的な状況下では、これらの VIC は活性化され、筋線維芽細胞様細胞または石灰化骨芽細胞様細胞に変化し、ECM にハイドロキシアパタイトを積極的に沈着させます。より硬い線維層に埋め込まれた VIC は海綿状層への石灰化の拡大を促進しますが、心室層は比較的影響を受けません。したがって、病気にかかりやすい線維芽細胞層などの環境で VIC を研究する能力は、CAVD 病理の理解を深める上で非常に重要です。 CAVD では、間葉系感受性弁細胞が線維化と石灰化によって引き起こされる組織の硬化に反応し、病態生理学的プロセスをさらに促進します。現在、CAVD に対する薬理学的治療法は存在しません。これは、(i) この複雑な環境を再現できる適切な実験モデルが不足しており、(ii) 新しく設計された大動脈弁 (AV) モデルの性能をベンチマークしていないためです。

米国ハーバード大学医学部のエレナ・アイカワ氏のチームは、人間の感受性線維層の生体力学的特性をシミュレートし、それを96ウェルプレートに3Dバイオプリントした生体材料ベースのCAVDモデルを確立した。細胞プロテオームと小胞オームは液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法によって分析され、3D バイオプリントモデルとヒト CAVD 組織を使用した従来の 2D 単一細胞培養モデルの違いが比較されました。 3D バイオプリントモデルは CAVD 細胞プロテオームを高度に再現しました (2D プロテオームの 70% と比較して 94%)。細胞と小胞のデータセットを統合して、AV 石灰化に一般的に関連する既知および未知のタンパク質を特定しました。この研究では、2D および 3D バイオエンジニアリングシステムが人間の疾患の独特な側面をどのように再現できるかを調査し、ハイスループットバイオエンジニアリングモデルシステムを評価する技術としてマルチオミクスを導入し、将来の創薬の可能性を提示します。関連研究は、2024年2月28日にトップの国際ジャーナルであるScience Advancesに「3Dバイオプリント大動脈弁アレイにおける疾患再現の指標としての細胞内プロテオミクスと細胞外小胞学」と題する論文として掲載されました。

1. 革新的な研究内容<br /> この研究では、細胞およびEVプロテオミクスを利用して、静的生体力学的特性の関数として発生する細胞およびEVプロテオームレベルの変化を評価することにより、in vitroモデルによる疾患の再現を包括的かつ全体的に特徴付けました。さらに、この研究では、ハイスループット薬物スクリーニングプラットフォームと互換性のある CAVD 病因の 3D バイオエンジニアリングモデルシステムを開発、検証、ベンチマークしました。

高スループットバイオプリンティングプラットフォームは、生体力学的に関連するCAVDモデルの配列を作成します。
ここでは、メタクリロイル化ゼラチンとヒアルロン酸 (GelMA/HAMA) を使用して、主要なヒト VIC を保持し、AV 特有の (および疾患主導の) 生体力学に合わせて調整されたハイドロゲルシステムを構築しました (図 1A および B)。使用された VIC は、ヒト CAVD 組織サンプルから抽出されました。バイオプリンティングパラメータは、ハイスループットスクリーニングに適した 96 ウェルプレートアレイに対応するように最適化され、ウェル間の一貫性を示しています (図 1B および C)。 VIC は ECM の硬さを感知して反応します。そのため、CAVD モデルを成功させるには、本来の大動脈弁の階層構造と一致する材料の硬さを再現することが不可欠です。紫外線（UV）硬化時間を調整することで、ハイドロゲルの機械的特性を操作し、以前の研究に基づき、ナノインデンテーション分析によって確認された、スポンジ状（疾患から保護された）弁層と繊維状（疾患に感受性のある）弁層の機械的特性を96ウェルプレートアレイ形式で再現しました（図1DおよびE）。ナノインデンテーション測定のヒートマップは、ハイドロゲル表面全体にわたって空間分解能を備えた一貫した生体力学的測定を示しており (図 1D)、定量分析は既知の層固有の生体力学的特性を再現しています (図 1E)。石灰化は主に大動脈弁の線維層で起こるため、その後の実験では線維層のハイドロゲルモデルが使用されました。

図1 大動脈弁モデルの3Dバイオプリンティング

96 ウェルのバイオプリントハイドロゲルアレイで、さまざまな (病理) 生物学的に関連する剛性にわたって生体力学的特性を幅広く調整できることを実証することにより、その後の実験では、疾患を起こしやすい大動脈弁領域の生体力学的特性を再現する、疾患に関連する原繊維ハイドロゲルに焦点を当てました。これまでの研究では、培養14日後、異なる培養条件下でのVICカプセル化ハイドロゲルモデルの石灰化は大幅に異なることが示されており、これが本研究の培養スケジュールの指針となりました。通常培地 (NM) または石灰化を刺激する 2 つの培地 (有機リン酸骨形成培地 (OM) または無機リン酸石灰化培地 (PM)) で 14 日間培養した後、繊維状ハイドロゲル内の VIC はすべての培地タイプおよび反復にわたって高い生存率を維持しました (図 2A、上部および B、左)。弁石灰化は、骨芽細胞様 VIC による活性ミネラル沈着やアポトーシスに伴う石灰化など、さまざまなプロセスの産物である可能性があり、後者は一般に in vitro 培養における人工的なプロセスであると考えられています。末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介デオキシウリジン三リン酸ヌクレオチド末端標識（TUNEL）染色では、すべてのハイドロゲルおよび培養条件においてアポトーシス関連の細胞死はほとんど見られず、石灰化は細胞死関連のカルシウム蓄積によって媒介される可能性は低いことが確認された（図2A、下、およびB、右）。フィブロネクチンの 96 ウェルハイドロゲルアレイの石灰化を、近赤外線カルシウムトレーサー (Osteosense 680) を使用して評価しました。すべての 3D アレイ培養条件で、ある程度の Osteosense680 陽性染色が示されました (図 2C)。しかし、OM および PM 条件下では、微小石灰化の数 (図 2D) と信号強度 (図 2E) は増加傾向を示し、統計的に有意でした。

図2 繊維層ハイドロゲルで培養されたVICは、有機リンおよび無機リン培養条件下で生存し、石灰化を誘導した。

細胞プロテオミクスは、3Dバイオプリントアレイでモデル化された独自の病理学的プロセスを特定します

細胞の生存と石灰化誘導が確認された後、質量分析法に基づくプロテオミクス手法を使用して、従来の 2D VIC 単一細胞培養条件と比較して、3D バイオプリント VIC ハイドロゲル CAVD アレイがネイティブ CAVD 組織表現型 (CAVD) を再現する能力を評価しました (図 3A)。 3D および 2D の両方の条件下で 2,500 を超えるタンパク質が特定され、2 つの in vitro モデル間で特定されたタンパク質の 99% 以上が重複していました (図 3B)。培養準備中に生成された可能性のある潜在的なバックグラウンド汚染物質を除去するために、細胞外ハイドロゲルのプロテオームのみを調査し、Hathewaya histolytica（コラーゲナーゼ由来）、ブタ（GelMA/HAMA由来）、ウシ（培養血清由来）、およびヒト（ターゲットプロテオーム相同性の同定用）のプロテオームと比較しました（図3B）。 CAVD組織由来の細胞はその後の解析に含められました（図3C）。フィルタリングされていない主成分分析（PCA）では、モデルタイプ（図2D）と石灰化培地処理（図3E、in vitroのみ）別に3つのタンパク質グループの偏りのないクラスタリングが示されました。測定されたプロテオームには 2D と 3D の in vitro モデル間で 48% の差異がありましたが、CAVD と 2D または 3D の間では 30% 未満の差異が観察されました。これは、in vitro モデルの細胞プロテオームが、新鮮組織の細胞プロテオームよりも互いに大きく異なっていることを示した (図 3F)。次に、2D と 3D の状態、および in vitro モデルと組織の間の重要な違いを特徴付ける遺伝子オントロジー (GO) 用語を特定しました (図 3、G' および G")。2D 培養のタンパク質は、血小板凝集、同型細胞間接着、標準的な解糖、およびアクチンフィラメントの脱重合に関連していましたが、3D 培養のタンパク質は、コラーゲン繊維の整列、タンパク質の N および O グリコシル化、COPI 被覆小胞の輸送、およびミトコンドリアの組織化に関連していました。最後に、免疫応答の調節、補体の活性化、および糖脂質輸送に関連するタンパク質は、分離された CAVD 細胞に豊富に存在し (図 3G)、これはネイティブ CAVD における免疫細胞浸潤の存在と一致しています。

図3 CAVDハイドロゲルモデルの細胞プロテオミクスにより病理学的プロセスを模倣する翻訳ターゲットが明らかになる

この研究の目的は、体外で培養された細胞のタンパク質含有量とCAVD由来の細胞のタンパク質含有量を相関させることでした。ペアワイズ相関分析の結果、すべてのin vitro培養条件は高い相関関係にあることが示されました（r > 0.9）。包括的なプロテオーム相関解析により、2D 細胞と 3D 細胞と CAVD 細胞の間に有意な相関関係があることが明らかになりました (2D ravg = 0.82、3D ravg = 0.79)。次に、2D および 3D タンパク質の存在量をすべての培地条件にわたって AV データセットと比較しました (図 4B および C)。 2Dモデルでは、ネイティブCAVDと比較して、NMは最も差次的に発現したタンパク質を持ち、PMは最も差次的に発現したタンパク質を持ちました（図4B）。対照的に、3Dアレイでは、CAVDと比較して差次的に発現したタンパク質を持つ細胞タンパク質はごくわずかでした（図4C）。全体として、3D モデルは測定されたタンパク質の 94% で CAVD 細胞内のタンパク質豊富さの特性を再現しましたが、2D モデルは 70% でタンパク質豊富さを再現しました。これは、3D モデルが、天然組織で観察されるものに最も近い疾患誘発中のタンパク質量の変化を特定するのに全体的に最適である可能性があることを示唆しています。

次に、タンパク質トレンド分析を使用して、2D および 3D 条件下で CAVD 細胞プロテオームを最もよく再現する主要なタンパク質を特定しました (図 4D ～ H)。 2D PM条件下では、CAVDの豊富さを再現するタンパク質は、細胞接着（CDH13およびARHGDIB）および細胞骨格の組織化（PACSIN2、CNN2、およびTHY1）と関連していました（図4D～F）。 3D条件下では、OM培養とPM培養の両方で、超分子繊維組織化（MFAP4、COL18A1、およびTMOD1）、リポタンパク質代謝（APOA1およびAPOE）、内皮細胞増殖の負の調節（SCG2、PDCD10）、および脂肪酸β酸化（ATFAおよびECHS1）に関連するCAVDタンパク質の豊富さが再現されました（図4G～I）。また、すべての 3D 培養条件にわたって CAVD 組織の一貫した傾向を示すタンパク質のセットも特定しました (図 4G、下部)。この偏りのない細胞プロテオーム中心の分析により、3D ハイドロゲルアレイは、2D 単一細胞培養では捉えられない疾患の独特な側面を再現することが明らかになりました。

図4 3Dバイオプリントモデルの細胞プロテオームは、石灰化条件下でのCAVD細胞病理を最もよく再現します

EVキャリアのプロテオーム研究によりCAVD病理における差異負荷が明らかに
証拠は、EV がアテローム性動脈硬化症および CAVD (石灰沈着性心血管疾患) において基本的な役割を果たしていることを示唆しています。体外でのCAVDモデリングにおけるEVの役割を評価するために、EVキャリアのプロテオーム解析を実施しました。この研究では、EV を分離し、ナノ粒子追跡分析によって適切なサイズ範囲を決定しました。単離されたEVのプロテオーム解析により、26の共通EVマーカーを含む1,300以上のタンパク質が同定されました（図5A）。主成分分析により、モデルと媒体標識EVプロテオームの間に明確なクラスタリングが明らかになった（図5BおよびC）。細胞プロテオーム解析とは対照的に、すべての培地条件（NM、OM、PM）において、in vitroモデル間で同様の数の異なるEVキャリアタンパク質が得られました（図5E）。しかし、EVプロテオームは全体的に安定しており、あらゆるin vitroモデルにおけるあらゆる培地処理で、総タンパク質の平均5％（977個のタンパク質のうち42個）のみが存在量が異なっていました（図5E）が、NM条件では細胞プロテオームの15％が異なっていました（図3H）。 2D モデルと 3D モデルの両方で、異なる EV カーゴタンパク質全体の 4% 未満が、異なる培地処理間で共有されており、各培地とモデルには独自の負荷応答があることを示唆しています (図 5F ～ H)。 2D NMモデルでは、EVベクターとの主な違いは、インテグリンを介したシグナル伝達（CD63、FLNA、FERMT2、およびFERMT3）とミトコンドリア膜関連アポトーシス（YWHAファミリー）に関連していました（図5F）。 OM EVカーゴの違いは、スーパーオキシド調節（PRDX2、APOA4、SOD2）および細胞外マトリックスアセンブリ（TNXB、PXDN、LAMB1、EMILIN1）と関連していた（図5G）。最後に、PM EVカーゴの変化はプラスミノーゲン（ENO1およびTHBS1）および細胞外マトリックス（VIM、MFAP4、およびEMILIN1）と関連していた（図5H）。

図5 EVプロテオミクスによりマトリックス依存性貨物負荷と普遍的な大動脈弁関連貨物が特定された

多段階オミクスデータセットの統合により、CAVD再発の主な要因が明らかになる

本研究の目的は、細胞およびEVプロテオームの異なる存在パターンを詳細に特徴付けた後、これらのプロテオーム間の関連パターンを調査し、さまざまな刺激条件下での3Dプリントハイドロゲルモデルおよび2D培養条件でCAVD病理を再現するタンパク質を特定することでした。この目的のために、本研究では、正規化正準相関分析（rCCA）（図6）と単一サンプルの線形補間ネットワーク推定（LIONESS）（図7）という2つの計算分析手法を利用しました。それぞれが関連の異なる側面を明らかにします。まず、本研究の目的は、細胞および EV データセット内のどのタンパク質が in vitro 石灰化モデルおよび一次 CAVD 組織の再現を促進するかを調べることでした。この研究では、rCCA を使用して、変数間の直交成分または最大相関を識別しました (図 6A ～ D)。代表的なコンポーネント 1 は 2D と 3D の in vitro モデル間で高い相関を示し、代表的なコンポーネント 2 は 3D モデルと CAVD 組織間で高い相関を示しました (図 6A)。相関円プロットは、典型的な成分間の関係を視覚化するために使用され、各ドットは細胞またはEVプロテオーム内のタンパク質を表します（図6B）。これらのデータを閾値化することで、各標準成分と有意に関連するタンパク質を特定しました（図6BおよびC）。同じタイプの相関関係を持つ変数（タンパク質）のサブセットのクラスターを観察しました（図6C）。対応する相関ネットワークは、細胞および EV キャリアタンパク質が石灰化ハイドロゲルと CAVD 組織間の関連を促進していることを示しました (図 6D)。この研究では、EV タンパク質は両方のデータセットの 10% 未満を占めているものの、in vitro モデルで CAVD と石灰化を促進するタンパク質の 30% 以上を占めていることがわかりました。 CAVD 組織で石灰化パターンを再現すると特定されたタンパク質の 98% (65 個中 64 個、正確な二項検定で P < 0.05) は、以前に心血管疾患に関係していることが判明していました (PheGenI、国立バイオテクノロジー情報センター)。これらの包括的かつ多段階のプロテオームプロファイリング手法により、石灰化の既知および未知の要因が特定され、この 3D ハイドロゲルモデルで CAVD 疾患を in vitro で再現する際の改善が確認されました。

図6 細胞およびEV由来のプロテオームを統合した石灰化モデルにおける疾患再現のネットワーク解析

最後に、本研究は、マルチオミクス統合とシステム生物学アプローチを使用して、これらのモデルにおける石灰化に関与する既知および未知のタンパク質を特定することを目的としています。図 7 に示すネットワークは、比較石灰化モデル (ケースと丸い四角)、細胞層と EV 層の 2 つの主要コンポーネント (ダイヤモンド)、およびこれらの主要コンポーネントにロードされたタンパク質 (円、細胞の場合は黄色、EV の場合はピンク) の 3 種類のノードで構成されたトップローディング情報です (図 6A)。タンパク質ノードは、モデル内での共有度に応じてさらに分類され、ネットワークは共有度が最も高いものから最も具体的なものへと整理されました（図 7 のレイヤー 4 から 1）。少なくとも 1 つの他の状態と共有される 60 を超える細胞および EV 由来のタンパク質 (図 7 のレイヤー 2 ～ 4) の中で、次元やリン酸化型とは無関係に CAVD モデルで石灰化を促進するタンパク質が強調表示されました。この包括的な分析では、細胞プロテオームと EV プロテオームの間で共有されるドライバーとして、ベノリン (VTN)、ガラクトース接着タンパク質 (MFGE8)、クラステリン (CLU)、およびカルレチニン L1H (S100A9) の 4 つのタンパク質のみが特定されました。偏りのないサブクラスターでは、生物学的プロセスを共有するタンパク質がグループ化されます（図7）。 3 つの条件で共有される細胞タンパク質と EV タンパク質の中で、顕著なプロセスには、ミトコンドリア代謝 (MAOB および MDH1)、細胞マトリックス接着 (THBS1、SOD3、および NID2)、およびアクチンフィラメント結合 (VIM、MSN、CFL2、SYNE3、TPM4、および TMSB4X) が含まれていました。タンパク質のわずか 19% (215 個中 41 個、正確な二項検定で P < 0.05) が、以前に弁膜症 (PheGenI、NCBI) と関連付けられていることが確認されました。この包括的な分析では、体外での石灰化の既知および未知の要因が強調されています。

図7 細胞およびEV由来のプロテオームのマルチオミクス統合により、石灰化に関与する既知および未知のタンパク質の差異的存在量をランク付け

図 8 は、各 in vitro モデルで疾患を最もよく再現する生物学的経路のグラフによる要約を示しています。この研究では、3D ハイドロゲルモデルが、ECM プロテオームのタンパク質プロファイル、細胞と ECM の相互作用、およびヒト CAVD 組織のミトコンドリアの代謝調節を再現できることがわかりました。しかし、2D モデルと 3D モデルの両方には、免疫/炎症反応に関して組織に見られる反応が欠けています。弁石灰化の文脈では免疫共培養研究は限られているが、最近の単一細胞研究では、石灰化弁膜症における異種細胞間コミュニケーションの重要性が示唆されている。この研究で提案されたモデルは、他の細胞タイプの共培養、（病態）生理学的周期的剪断/伸張、および追加の層固有の生体力学など、さらに複雑性を増大させるための基礎を提供します。私たちの研究は繊維層と海綿状層の特性に焦点を当てていますが、エラスチンが豊富で病気から保護された心室内層は、培養条件下で生体内で独特のタンパク質シグネチャを生み出すことが示されており、圧縮応力ではなく引張応力に対する弁の生理学的反応に主に対応していると考えられます。

図 8. 各モデルにおける CAVD 組織の再現を細胞と EV の観点から要約した GO 用語。

2. まとめと展望
NM 条件下では軽度の自発的な石灰化が確認されましたが、これはバイオプリンティングプロセス中にせん断応力と最大 75 bar の圧力にさらされたことが原因と考えられます。この 2 つの圧力はどちらも筋線維芽細胞の活性化を引き起こすことが示されています。さらに、この実験で使用された VIC は、病気にかかった人間の弁から採取されたものであり、私たちのチームが以前に実証した骨形成性筋線維芽細胞様細胞の集団が含まれていた可能性が高い。それにもかかわらず、3D 培養では、石灰化培地処理条件下では NM コントロールと比較して細胞と EV キャリアに顕著なプロテオーム変化が見られ、このモデルの実現可能性が実証されました。ここでは、ボトムアッププロテオミクスによって特定されたペプチドの種特異性を利用して、細胞外マトリックス (ECM) やその他の潜在的な汚染物質の背景プロテオームをキュレートしました。今後の研究では、この研究では ECM をターゲットにしたプロテオーム技術を使用して、コラーゲンアイソフォーム、翻訳後修飾、および細胞マトリックス相互作用に対する機械的応答を特定することを目指します。これらの技術は、ハイドロゲルに使用されるさまざまなマトリックス微小環境に対する細胞および EV の反応を評価するためにも使用できます。この EV 分析は、EV および微小小胞の分泌を促進する因子とそれに対応するプロテオームを特定するために拡張することもできます。

ソース：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj9793

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