バイオファブリケーション: ゼラチンと脱細胞化骨粒子からなるバイオインクを使用した細胞印刷

出典: EngineeringForLife

バイオファブリケーションのアプリケーションが直面している大きな課題の 1 つは、印刷可能性、形状の忠実度、細胞の生存率、組織の成熟度のバランスが取れたバイオインクをどのように入手するかということです。脱細胞化法では、天然の細胞外マトリックスを抽出し、組織特有のマトリックスタンパク質を保持することができます。しかし、骨の脱細胞化における主な課題は、骨の自然な構成と機能を維持するために、有機成分（コラーゲン、プロテオグリカン）と無機成分（ハイドロキシアパタイト）をどのように保持するかということです。さらに、機能性バイオインクを開発するためには、バイオインク配合物における組織ベースの添加剤としての脱細胞化骨（DB）粒子の役割を調査する必要があります。

トルコのイズミール工科大学の Aylin Kara Özenler 氏のグループとドイツのエアランゲン・ニュルンベルク大学の Aldo R Boccaccini 氏のグループは、ゼラチン (GEL) と前骨芽細胞 (MC3T3-E1) またはヒト間葉系幹細胞 (hTERT-MSC) を含むバイオインク配合物に、さまざまなサイズ (≤45 μm および ≤100 μm) および濃度 (1%、5%、10% (重量パーセント)) の脱細胞化骨粒子を添加した場合の効果を評価しました。さらに、本研究では、ゼラチン、DB粒子、細胞を使用したシンプルなバイオインク製剤を提案し、調製プロセスが簡単で細胞生存率が高いことを明らかにしました。この研究ではインクの印刷性能を評価しました。さらに、ずり流動化試験およびチキソトロピー試験によってレオロジー特性を測定しました。バイオプリントされた構造は28日間培養されました。細胞の生存率、増殖、骨形成分化能力は、生化学分析と蛍光顕微鏡を使用して評価されました。 DB 粒子の添加により細胞増殖と骨形成分化が促進されましたが、これは DB 粒子に天然コラーゲンとハイドロキシアパタイトが含まれているためと考えられます。 DB 粒子の使用後、特に骨形成が誘導されていない場合、アルカリホスファターゼ活性が大幅に増加しました。さらに、蛍光画像により、細胞と材料の間の明確な相互作用と、構造内部への細胞の付着が明らかになりました。これらの有望な結果により、現在の容易なバイオインク製剤は、骨組織工学の潜在的な候補であり、調製が簡単で細胞活性が高い臨床適用可能な材料であると考えられています。関連研究は、2024年3月13日に国際的に有名なジャーナル「Biofabrication」に「ゼラチンと脱細胞化骨粒子からなるバイオインクを使用したマウス前骨芽細胞とヒトMSCの3Dバイオプリンティング」と題する論文として掲載されました。

1. 革新的な研究内容

この研究の目的は、ゲル、DB 粒子、細胞からなる最小のバイオインク配合物を開発し、ゲルマトリックス内の DB 粒子のさまざまなサイズと濃度が細胞の挙動に与える影響を評価することでした。研究の概略図を図1に示します。これまでの研究では、DB 粒子とバイオマテリアルインクとしての GEL の組み合わせが MC3T3-E1 前骨芽細胞に有益であることがわかりました。この研究では、GEL/DB 複合バイオインク配合物をマウス前骨芽細胞 (MC3T3-E1) とヒトテロメラーゼ逆転写酵素修飾間葉系幹細胞 (hTERT-MSC) でテストしました。さまざまなサイズと濃度の DB 粒子をゲルマトリックスに組み込むことで、細胞の挙動を強化しながら印刷可能な処方を実現しました。この研究で以前に報告されたように、粒子サイズが 100 μm の場合、粒子濃度が高いと印刷性が低下します。そのため、この研究の仮説は、粒子サイズを小さくすると印刷性が向上し、DB 粒子濃度が増加すると細胞挙動も増加する可能性があるというものでした。したがって、本研究では、2 種類の異なる細胞タイプを使用したバイオインク配合物における異なるサイズの DB 粒子の効果を評価しました。 mTG との架橋により、3D バイオプリント構造の安定性が維持されました。すべての 3D バイオプリント細胞搭載 GEL/DB 構造は、28 日間の培養期間中に細胞適合性、生体活性、および骨形成分化について評価されました。
図1 研究の概略図
【レオロジー特性】

この研究では、印刷プロセスに関連するインクの流れの条件をシミュレートするために、GEL および DB が埋め込まれた GEL バイオマテリアルインクのレオロジー特性を評価しました。各グループに対してずり流動化実験を実施し、ずり速度を0から100 s-1まで増加させて粘度を測定した。図 2A は、すべてのバイオマテリアルインクの粘度がせん断速度の増加とともに低下することを示しており、すべての材料が押し出しベースの 3D 印刷に適したせん断減粘挙動を示すことを示しています。せん断速度10s-1でGELの粘度は74Pa.sと測定され、DB粒子を添加した群と比較して統計的に有意であった（図2(B)）。さらに、異なるサイズと濃度の DB 粒子の添加も粘度に影響を与えました。 GEL/1 DB（100 μm）、GEL/5 DB（100 μm）、GEL/5 DB（45 μm）、GEL/10% DB（45 μm）の粘度はそれぞれ91.70、111.61、123.84、170.67 Pa.sと測定され、統計的に有意な差がありました（図2（B））。 45 μm DB 粒子は 100 μm DB 粒子と比較してインクの粘度を増加させ、統計的な差は粒子サイズが小さいほどレオロジー特性が向上することを示しました。図2(B)に示すように、10% DB粒子を配合したインクの粘度が高くなることは注目に値します。これはインク内の粒子間の相互作用によるものと考えられます。せん断減粘挙動は、複合インク配合物内の固体粒子間の相互作用がせん断力によって破壊されたときに発生します。インクは静止しているときに粘度が高くなります。これは、懸濁粒子間の相互作用の再編成によって決まり、形状の安定性が得られます。したがって、より小さなサイズの DB 粒子の濃度が高くなるほど、懸濁粒子間の相互作用が密になり、粘度が高くなります。さらに、本研究チームによる以前の研究では、DB 粒子の濃度が高い (> 5%) と印刷性が低下する一方で、DB 粒子の濃度が高いと細胞の成長が促進されることがわかりました。この研究では、DB 粒子のサイズが小さいほど、高濃度でのレオロジー特性が向上することが判明しました。これがこの研究の仮説の 1 つです。

図2 インクと3Dプリントハイドロゲルのレオロジー特性と印刷性能評価
【3DプリントGEL/DBブラケット】
この研究では、GEL インクと GEL/DB インクの印刷性を評価しました。光学顕微鏡画像には、トランスグルタミナーゼで架橋した後の、さまざまなサイズと濃度の3DプリントGELおよびGEL / DBハイドロゲルが示されています（図2（D））。ハイドロゲルは、0°/90°の支柱構造が交互になった円筒形に製造され、支柱間に四角いマクロ孔が形成されました。 3DプリントされたGELおよびGEL/DBハイドロゲルは、正方形の細孔形状を持つ良好に印刷された構造を示した（図2（D））。すべてのインクは簡単に印刷できましたが、特に DB 粒子のサイズが小さく (45 μm)、濃度が高い方が印刷に適していました。これは、GEL マトリックス内に均一に分散された浮遊した小さな DB 粒子間の相互作用の結果であると考えられます。純粋なGELハイドロゲルは透明であったが、GEL/DBハイドロゲルの濁度は粒子濃度の増加とともに増加した（図2（D））。すべてのグループの印刷性係数（Pr）は式（1）を使用して計算されました。 Pr < 1 は、丸い孔の角を持つゲル化不足のインクを示します。Pr = 1 は、完全な正方形の孔形状を持つ適切なゲル化を示します。Pr > 1 は、ゲル化が過剰のインクを示します。すべてのグループの Pr 係数は 1 に近かった。 5% DBを含むGEL群は、より低いPr係数（Pr = 0.9 ± 0.04）を伴う円形の細孔形状を示し、この研究では純粋なGELハイドロゲルと比較して統計的な差が認められた（図2（E））。これまでの報告によると、3D プリントされたハイドロゲルは、Pr 係数が 0.9 ～ 1.1 の場合に適切なストランド形態を示します。したがって、5% DB 粒子 (サイズ 100 μm) は 3D 印刷のパフォーマンスを低下させましたが、5% DB 粒子 (サイズ 45 μm) は最高の印刷パフォーマンスを示しました。また、5% DB粒子（粒子径45μm）のPr係数は0.9であり、十分な印刷性と形状忠実性を有していました。粒子サイズを 45 μm に小さくすると、純粋な GEL グループと比較して 5% DB グループの印刷性が向上しましたが、統計的な差はありませんでした。

GEL/DB構造を搭載したバイオプリントMC3T3-E1前骨芽細胞
本研究では、1% GEL/DB 構造体を搭載した MC3T3-E1 前骨芽細胞の生成に成功し、細胞培養中に光学顕微鏡を使用して構造体内の細胞の分布と局在を観察しました。図 3 は、GEL および GEL/DB 構造と TCP (組織培養ポリスチレン) コントロール内の細胞の光学顕微鏡画像を示しています。バイオプリンティングの前に、MC3T3-E1 を含む 2D キャスト GEL および GEL/DB ハイドロゲルを準備し、ハイドロゲル内の細胞を観察しました。 GEL ハイドロゲルは完全に透明なので、ハイドロゲルの端を区別するのは容易ではありません。図3(A)に示すように、GELとGEL/DBハイドロゲルの両方で細胞が観察され、7日後には付着して伸長した細胞が観察されました（図3(A)）。さらに、GEL/DBハイドロゲル中のDB粒子に細胞が付着していることが観察された（図3（A））。 3Dバイオプリントサンプルでは、MC3T3-E1細胞がGELおよびGEL / 1％DB構造内に分布し、細胞培養期間中増殖し続けました（図3（B））。さらに、図3（C）の拡大画像に示すように、14日後には細胞が構造の表面に移動し、3Dバイオプリント構造を完全に覆いました。以前に報告されたように、GEL ハイドロゲルは 14 日後に分解し、細胞培養培地中で重量が減少し始めました。 GEL が分解し始めると、細胞は 3D プリントされた構造内に空間を見つけ、その内部を移動できるようになります。培養期間中、構造が分解され細胞が増殖するにつれて、拡大画像（図3（C））に示すように、細胞が構造の外側に移動し、細胞培養プレート上で観察されました。さらに、GEL の特定の RGD 配列により、培養期間全体にわたって細胞の接着と増殖が可能になり、GEL と GEL/DB バイオインク製剤の細胞適合性が実証されました。
図 3 細胞充填 2D キャストおよび 3D バイオプリント構造の光学顕微鏡画像。3D バイオファブリケーション構造では、細胞の生存率と 3D プリント構造の形状忠実度または安定性を維持することが重要な要素です。したがって、3D バイオプリント構造内の MC3T3-E1 細胞の生存率は、培養中に生死染色を行った後に観察されました。蛍光顕微鏡画像には、生細胞（緑）、死細胞（赤）、細胞核（青）が表示されます（図 4）。 DB 粒子は自己蛍光により青/緑にも見えます。画像は、MC3T3-E1細胞が7日目にGELおよびGEL/DB構造物に付着し、その中で生存していることを示した（図4（A））。 14日後、細胞は構造内にさらに付着して広がり、死んだ細胞はわずかしか観察されなかった（図4（A））。培養14日後、DAPI染色により密集した核が確認されました。さらに、2D細胞充填GELおよびGEL/DBハイドロゲル中のMC3T3-E1細胞は14日目でも生存していた（図4（B））。生死染色の結果、GEL および GEL/DB インク配合物は細胞適合性があり、MC3T3-E1 細胞の生存率を損なわないことが確認されました。

図 4 MC3T3-E1 細胞の生死染色結果。インクの細胞毒性効果は、28 日間の培養期間中に LDH 細胞毒性アッセイを使用して評価されました。 2D細胞培養では、細胞は同様のレベルの細胞外LDHを放出し、28日間の培養期間にわたって統計的な差は見られませんでした（図5（A））。しかし、1日目には3Dバイオプリンティング群のLDHレベルが有意に高かった（図5（A））。初期段階での LDH レベルが高いのは、3D バイオプリンティング中のせん断力によって引き起こされる細胞死によるものと考えられます。その後の培養日には、細胞外 LDH レベルが統計的に有意に減少し続け、残りの細胞がその後の培養で生存し増殖したことを示しています。 MC3T3-E1細胞の生存率はWST-8法で測定した細胞代謝活性に基づいて定量化され、各グループの細胞の生存率は培養プロセスを通じて徐々に増加することが示された（図5（B））。さらに、3D バイオプリントされた GEL および GEL/DB 構造の細胞生存率は高く、2D 鋳造グループと比較して統計的に有意な差がありました。さらに、3DバイオプリントGEL/DB構造における細胞生存率は他のグループと比較して最も高かった（図5（B））。

細胞の増殖と形態
この研究では、PicoGreen アッセイを使用した dsDNA の定量化に基づいて、バイオプリント構造内の細胞増殖を評価しました。代謝活動に基づく生存率の結果（図5（B））と一致して、バイオプリント構造内の細胞数は細胞培養期間中に徐々に増加しました（図5（C））。初日には、バイオプリント構造内の細胞数は 2D キャストハイドロゲル内の細胞数よりも少なかったが、これは図 5(A) に示すように、初日に LDH 放出量が多かったためと考えられる。 1 日目以降、2D キャストハイドロゲルグループの細胞数は 7 日目に増加し、その後培養期間を通じて安定したままでした。一方、3D バイオプリント構造内の細胞は 28 日間にわたって増殖を続け、2D ハイドロゲルと比較して 7 日目、14 日目、28 日目に統計的に有意な差が見られました。さらに、21日目には、バイオプリントされたGEL / DB構造内の細胞数が最も多く、3DプリントされたGELグループと比較して統計的に有意な差がありました（図5（C））。細胞毒性、生存率、増殖の調査によると、GEL と GEL に DB を加えたバイオインクは、バイオプリンティング後の細胞成長のための 3D 微小環境を提供し、天然ベースの最小化されたバイオインク配合として良好な結果を示しました。

この研究では、蛍光顕微鏡を使用して、3D バイオプリント構造と 2D キャストハイドロゲル内の細胞接着と細胞形態を評価しました。 DAPI および F-アクチン染色により、それぞれ MC3T3-E1 細胞の核 (青) と細胞骨格 (緑) が示されました。顕微鏡画像では、2D キャストおよび 3D バイオプリント構造への細胞接着、および培養 28 日後の細胞と材料の相互作用が示されました (図 5(D))。 2D鋳造群では28日目に細胞と材料の相互作用が見られ、GELハイドロゲルに埋め込まれたDB粒子の表面が細胞で覆われていた（図5（D））。 3DバイオプリントGEL/DB群では、細胞が構造を覆い、DB粒子と非常に活発な相互作用を示し、さらに、28日目には細胞が細孔領域を覆っていたことが拡大画像から確認できた（図5（D））。

図 5 GEL および GEL/DB 構造内での細胞増殖 [hTERT-MSC を搭載した 3D バイオプリント GEL/DB 構造内での DB 粒子の異なるサイズと濃度が細胞挙動に与える影響の評価]

この研究では、生死染色を使用して 3D バイオプリント構造内の細胞生存率を評価しました。蛍光顕微鏡画像では、28日間の培養期間中、細胞がGELおよびGEL/DB構造内で生存し、増殖したことが示されました（図6）。さらに、DB 粒子はコラーゲン繊維の自己蛍光により青く見えました。初日には、すべてのグループで多数の生存細胞 (緑) が観察され、特に DB 結合構造で細胞クラスターが検出されました。粒子の高密度と自己蛍光のため、hTERT-MSC は初日にははっきりと見えませんでした。しかし、特に10％DB群では、緑色に染色された領域が広く、構造内に細胞クラスターが形成されていることが示されました（図6）。 7日後、細胞はバイオプリント構造内で伸長し広がり始め、その後、細胞は生存し続け、28日間の培養期間中増殖し続けました。 hTERT-MSC は良好に増殖し、培養 28 日後には完全な細胞被覆が観察されました。さらに、生細胞の密度はすべての培養日で高かった。 28 日目でも死細胞 (赤) はほとんど見られませんでした。これは、インクの配合が細胞適合性であり、DB 粒子の濃度が高いほど細胞の成長が促進されることを示しています。

図 6 3D バイオプリントされた GEL および GEL/DB 複合構造における hTERT-MSC 細胞の 14 日目の生/死染色結果。バイオプリント後、LDH 細胞毒性アッセイを使用して、インク材料の潜在的な細胞毒性を定量化しました。細胞を含む構造体を 28 日間培養し、各時点で細胞培養上清中の細胞外 LDH 放出を定量化しました。結果は、培養プロセス全体を通じて、各グループの LDH レベルが安定しており、増加していないことを示しました。時点およびグループ間で統計的な差は見られず、GEL成分を含むDBはhTERT-MSCに対して細胞毒性効果を及ぼさないことが示された（図7（A））。 GEL構築物にウサギDB粒子を添加した場合（図4および5）、ウシDB粒子もhTERT-MSCに対して細胞毒性効果を示さなかった。

図 7 バイオプリントされた GEL/DB 構造内の hTERT-MSC 細胞の生物活性この研究では、共焦点顕微鏡を使用して、3D バイオプリント構造内の細胞形態と細胞付着を詳細に評価しました。核（青）と細胞骨格（緑）はそれぞれDAPIとF-アクチンで染色されました（図8）。さらに、DB 粒子内の線維状コラーゲンの自己蛍光により、構造内の DB 粒子もはっきりと見えました (赤/ピンク色)。画像は、28日目に3Dバイオプリント構造内で細胞が成長し増殖していることを示しました（図8）。細胞は GEL および GEL/DB 構造内に付着して伸長し、すべてのグループで細胞被覆の傾向が見られました。特に、10% DB を含む GEL 構築物では、より大きな細胞ネットワークと DB 粒子との良好な相互作用が観察されました。この細胞接着は、細胞が GEL/DB グループ内で均一に分散された DB 粒子と理想的に相互作用したことを示しています。

図8 3DバイオプリントGELおよびGEL/DB構造で培養されたhTERT間葉系幹細胞の培養28日目の共焦点顕微鏡画像
2. まとめと展望<br /> この研究では、GEL、DB 粒子、MC3T3-E1 前骨芽細胞または hTERT-MSC で構成される最小限のバイオインク製剤が実証されました。この研究の主なアプローチは、骨組織の天然の ECM 成分を活用し、より良い細胞反応を得るための理想的な粒子濃度を決定することでした。この研究で使用された DB 粒子にはコラーゲン繊維だけでなくハイドロキシアパタイトも含まれていましたが、既存の研究では脱細胞化と脱灰の両方のプロセスが使用されており、骨のバイオミネラル化特性が弱まっていました。さらに、本研究では、GEL 架橋 mTG (FDA 承認材料) に基づくシンプルなバイオインク製剤を提案しました。これは、細胞毒性があり臨床使用できない複数の修飾子や化学成分を使用した複雑なハイドロゲルシステムと比較して、直接調製できます。

出典: https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad2c98

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