「ラボオンチップ」: 7 μm の細孔を持つ生体適合性 3D プリント等孔膜の統合

出典: EngineeringForLife

等多孔膜（平行で整然とした孔を持つ膜）は、バイオセンシング、薬物検査、薬物送達、臓器オンチップ技術、細胞分画、その他のバイオ分離など、多くの機械的および生物学的用途に最適です。多孔質膜に対する幅広い関心により、市販の膜の使用、イオントラックエッチング、ハイドロゲル、その他のステレオリソグラフィー手法など、数多くの製造技術が生まれました。さらに、市販の膜をターゲットデバイスに位置合わせ、接着、またはその他の方法で統合する必要があり、製造時間と複雑さが増し、細胞毒性がある可能性のある追加の材料が必要になります。

米国ブリガムヤング大学のグレゴリー・P・ノーディン氏のチームは、従来の3Dプリンターのハードウェアを改良することなく、3Dプリント部品のネガティブフィーチャーにおいてネイティブのデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）解像度を実現できる新しい3Dプリント技術を提案し、7μmという小さな孔径を持つ完全に統合された生体適合性等多孔膜の製造を実証しました。この技術を使用して、統合された異多孔膜を含む、確立された臓器オンチップ構成を模倣したマイクロ流体デバイスを構築しました。 2 つの細胞集団が膜の両側に播種され、他の臓器オンチップアプリケーションの概念実証として画像化されました。これらの 3D プリントされた等多孔膜は、他のさまざまな機械的および生物学的用途に使用でき、シームレスに統合された 3D プリントされたマイクロ流体デバイスの新しい可能性を生み出します。関連研究は、2024年3月14日にトップクラスの国際ジャーナル「Lab on a Chip」に「7μmの細孔を持つ統合型生体適合性3Dプリント等多孔膜」と題する論文として掲載されました。

1. 革新的な研究内容

この研究では、これらの障害を克服するための新しい 3D 印刷方法を提案します。製造された多孔質膜は、孔のサイズと密度を制御でき、3D プリントの一部としてその場で製造されます。まず、従来の 3D 印刷技術で何が実現できるかを紹介し、次に、3D 印刷された部品にネイティブのマイクロミラー寸法の空隙を実現できる新しい露光方法を開発し、最小 7 μm の細孔を持つ多孔質膜を実現します。このサイズのウェルは、肺や膵臓のモデルを含む多くの臓器オンチップアプリケーションに適しています。次に、2 つの蛍光細胞集団を膜の両側に別々に播種し、共焦点蛍光顕微鏡を使用して 3D スキャンしたところ、細胞は膜に付着しているものの、両側で物理的に区別されたままであることが示され、一般的な臓器オンチップトポロジーを模倣しました。

OpenSCAD を使用すると、3D STL モデルが生成され、カスタムスライスソフトウェアを使用してスライスされ、個々の露出の画像が生成されます。図 1 は、多孔質膜の形状の斜視図と、露出に使用された個々の画像を示しています。印刷後、3D プリントされた部品は、未硬化の 3D プリント樹脂を除去するために 2-プロパノールで洗浄し、乾燥させた後、硬化面で 11.3 mW cm-2 の放射照度を持つ 430 nm LED (Thorlabs、米国ニュージャージー州ニュートン) を使用してカスタム硬化ステーションで 20 分間後硬化されました。

図1 多孔質膜の3D CAD設計

【従来の3Dプリント方法の評価】
従来の 3D プリンティングでは、通常、同じ厚さと露光時間を持つレイヤーの作成に制限されています。この研究では、10 μm の厚さの層と 100 ～ 300 ms のさまざまな層の露出時間を使用して、このアプローチで達成可能な最小の細孔を評価しました。図2(ac)は、設計された細孔幅が5ピクセルまたは38μmの場合の結果を示しています。露光時間が短い場合、細孔は設計よりもはるかに大きくなることに注意してください（図 2(a および b)）。通常、絞りサイズが設計されたサイズと一致するまで、露出時間を長くして絞りサイズを小さくします。図2(c)に示すように、この方法は38μmの小さな細孔にも適用できます。しかし、より小さな細孔（図2(d-f)）の場合、細孔は設計サイズに達する前に閉じて完全に満たされ、固体のフィルムを形成します（図2(f)）。結果は、従来の 3D 印刷方法を使用して、設計と露出設定の組み合わせで約 30 μm より小さい孔を生成できないことを示しました。

図2 従来の3Dプリント法による細孔形成の限界
ゼロ厚層

この研究では、露光時間が非常に短い場合、露光された領域は設計された 10 μm の深さまで完全に重合せず、その結果、以前に露光されたバルク材料からフィルムが引き裂かれ、図 2(a) に見られるものと同様の欠陥が発生することがわかりました。この問題を緩和するために、厚さゼロの層を作成するというアイデアが導入されました。図3(a)に示すように、各層ごとにビルドプラットフォームは上昇した位置から開始します。図3(b)に示すように、通常の10μmの層の場合、3Dプリント部品の底部と樹脂トレイの間に10μmの隙間ができるまで下げます。次に、UV 光源をアクティブにして、図 3(d) の赤い領域に示すように、厚さ 10 μm の新しい層を形成します。最後に、ビルドプラットフォームを上げて、次の層用のパーツを準備します (図 3(f))。厚さゼロの層の場合、3Dプリントされた部品と樹脂トレイの間に隙間がなくなるまでビルドプラットフォームを下げます（図3（c））。その後の紫外線照射により、前の層がさらに重合され（図3(e)）、非常に短い照射時間で非常に細いフィラメントを持つフィルムを製造できるようになります。この露光に使用される画像は、新しく露光された層と既存の部品との間の適切な接着を確保するために、既存のブロック材料と十分に重なる必要があります。そうしないと、フィルムとフィラメントが裂けてしまいます。通常の場合と同様に、ビルドプラットフォームが上昇して次のレイヤーの準備が完了すると、レイヤーが完了します (図 3(g))。
図 3 ゼロ厚さ層の概略図この研究では、ゼロ厚さ膜の単層を使用して、38 μm (5 画像ピクセル) から 7.6 μm (1 画像ピクセル) の範囲の孔サイズを持つ膜を製造しました。典型的な結果を図 4 に示します。各行は異なる設計絞りを表し、各列は異なる露出時間を表します。左端の列は、100 ミリ秒の露光時間を表し、印刷プロセスで生き残り、バルク材料に付着したままになっているフィラメントを含む非常にまばらなフィルムを示しています。図4(m)に示すように、露光時間が短くても、孔径が7.6μmになると孔が閉じ始めます。次に、設計サイズに近い小さな絞りを得るために、露出時間を長くしました。図 4 の中央の列は、中間露光時間 150 ms の効果を示しています。設計サイズが 22 μm より大きい膜の場合、露出時間を長くすると孔が小さくなる効果はありますが、それでも設計サイズよりはるかに大きくなります (図 4 (b、e、h) を参照)。さらに、15.2μmの細孔は100msの露光時間中に開いていたが（図4(j)）、現在は部分的に閉じており、まだ設計サイズには達していない（図4(k)）。 7.6μmの細孔は完全に閉じていた（図4(n)）。図 4 の右の列は、露出時間を 200 ミリ秒に長くした場合の効果を示しています。設計サイズが30μmより大きい細孔はわずかに縮小しましたが、それでも設計サイズには達しませんでした（図4（cおよびf））。設計サイズ22.8μmの開いた気孔もわずかに収縮しましたが、閉じ始めました（図4（i））。設計サイズが20μm未満の細孔は完全に閉じられています（図4（lとo））。これらの結果は、達成可能な最小の孔サイズが依然として約 30 μm であり、露出時間を増やしたり設計サイズを縮小したりしても、より小さな孔は生成されないことを示しています。

図4 単層ゼロ厚細孔製造の限界
ゼロ厚層を繰り返す

この研究では、ゼロ厚層を多く使用することで、より小さな気孔を形成できることがわかりました。まず、通常は細かいメッシュが生成される露出時間を選択し、その露出時間を使用して厚さゼロのレイヤーを繰り返し作成します。最初の層は膜の底をフィラメントのグリッドに形成し、後続の層は各フィラメントを広げることでそのグリッドを構築し、最終的に孔サイズが小さくなりながら徐々に広いグリッドを作成します。ここで鍵となるのは、プラットフォームを構築する動きであるようだ。この研究では、各露光間のビルドプラットフォームの上下運動により液体樹脂内で 3D プリントされた部品が動くことで樹脂が攪拌され、部分的に重合した樹脂がフィルムグリッドから離れ、その結果、次の層のために細孔の間に新しい樹脂のプールが提供されるという仮説を立てています。次の露光では、既存のフィラメントの近くのみが完全に重合してフィラメントが広がり、一方で、細孔内の部分的に重合した樹脂は次の露光の前に除去されます。このプロセスは、毛穴が希望のサイズに達するまで繰り返されます。図 5 は実際のアプリケーションの状況を示しており、各ゼロ厚さ層の露光時間は 100 ミリ秒です。各行は設計された開口部を表し、各列はゼロ厚さの層の異なる数を表します。設計された孔径が38μmの膜の場合、厚さゼロの膜を5層重ねると、依然として不規則な孔径の膜が生成されますが（図5（a））、厚さゼロの膜を30層重ねると、均一な孔径の膜が生成されます（図5（c））。設計された孔径22.8μmの膜は、図5(df)に示すように同様の挙動を示した。最小の孔サイズである 7.6 ミクロン (単一の画像ピクセル) では、パフォーマンスが低下しました。厚さゼロの層を繰り返すと、膜の一部の領域で孔径が 7 μm まで減少しましたが、膜は最終的に、特に膜の中心付近で変形しました (図 5(gi))。

図5 異なる開口部を持つ繰り返しゼロ厚さ層の効果
[サポート構造を追加]
7 μm ほどの小さな孔を実現できますが、特に高い充填率を持つ小さな孔 (<20 μm) が必要な場合、結果として得られる孔グリッドは非常に不規則になる可能性があります (図 5(gi) の膜の中央領域の欠陥に注意してください)。これは、最初の数層が形成され始めるときにフィルムが機械的に不安定になるためだと考えています。細いフィラメントは、液体樹脂の中を移動する際に、ビルドプラットフォームの動きによって簡単にずれてしまいます。この問題を緩和するために、下部サポート柱を追加することができます。図6(a)はフィルムの下に配置された支柱（赤）を示しています。図6(b)は膜を省略した後の柱の外観を示しています。図6(c)では、支柱の幅が個々の細孔間のスペースよりも大きいため、細孔が部分的に閉塞していることに注意してください。図6(d)に示すように、支持体は初期構造の安定性を向上させ、既知のスパン制限なしに7μm×7μmの均一な細孔を生成します。これらのフィルムを製作するには、非常に精密な光学フォーカスが必要です。適切な焦点が達成され、適切な露出時間と繰り返しレイヤー数が決定されると、高い成功率でフィルムを繰り返し製造できます。フィルムは最初は薄いですが、露出を重ねるごとに厚くなります。平均フィルム厚さは 12.6 ミクロンと測定されました。より高い細孔充填率が必要な場合は、図 7 に示すように、8 μm の細孔を持つチェッカーボードパターンも生成できます。チェッカーボードパターンは、300 ミリ秒のバッチ露光時間と、100 ミリ秒の露光時間で 25 層のゼロ厚フィルムを使用して生成されました。このチェッカーボードパターンは製造が非常に難しく、現在では約 60 ミクロンの幅のパターンしか製造できません。
図 6. 30 層のゼロ厚膜と支持柱で構成された等多孔膜。図 7. 25 層のゼロ厚膜で作られた等多孔膜。8 μm の細孔を持つ高充填率のチェッカーボードパターンを示しています。
【臓器チップ型デバイスへの組み込み】
図 6(c) に示すものと同様の膜を使用して、膜チャンバーにキャップとチャネルを追加し、膜の両側に細胞培養を播種できるようにした、完全に 3D プリントされたマイクロ流体デバイスが製造されました。装置のCAD図面を図8(a)と(b)に示す。細胞は上記のように播種され、画像化され、得られた画像は図8(cf)に示されています。図8(c)は膜の顕微鏡画像を示しており、下にある支持体と細孔がはっきりと見えます。図8（d）と（e）はそれぞれ上面図と斜視図であり、両方の細胞集団がはっきりと見えます。最後に、図 8(f) は、両方の細胞集団が膜の表面に付着しているが、膜の両側で物理的に区別されており、多くの臓器オンチップアプリケーションに見られる共通のトポロジを模倣している側面図を示しています。

図8 膜上に2つの細胞集団を播種した膜デバイスのCAD図面と3D共焦点蛍光画像
2. まとめと展望<br /> 従来の 3D 印刷プロセスには大きな制限があります。この研究は、3D プリンターのハードウェア自体を変更することなく、より小さな空隙を作成する機能を導入することで、一般的な 3D 印刷技術を拡張します。具体的には、この技術により膜内の空隙を正確に配置することが可能となり、孔のサイズ、位置、密度が制御された等多孔膜を作成できます。このアプローチでは、膜がデバイスの他の部分と同じ材料からシームレスに製造され、追加の材料やプロセスが不要なため、高度に統合されたマイクロ流体デバイスの製造が高速化され、簡素化されます。さらに、この技術は生体適合性樹脂と互換性があるため、臓器オンチップなどの生きた細胞を扱う用途に非常に役立ちます。この技術は他の 3D プリンターや樹脂にも応用できる可能性があり、特にマイクロ流体における 3D 印刷プロセスの精度と汎用性が向上します。

出典: https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/lc/d4lc00014e

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