脊髄損傷の修復のための 3D バイオプリント神経組織足場

神経幹細胞（NSC）移植は神経回路と機能の部分的な再構築を実現でき、脊髄損傷（SCI）の有望な治療法です。しかし、病変部位に直接移植された NSC は生存率が低く、制御不能な分化を起こしやすい傾向があります。 3Dバイオプリンティングは、NSCの均一な分布と正確で複雑な脊髄のような構造を備えた細胞搭載スキャフォールドを構築できるため、NCSに適した微小環境を提供し、病変領域での細胞-スキャフォールドおよび細胞-細胞の相互作用を促進することが期待されます。これは、外因性NSCが体内で神経再生と軸索接続を実行するために非常に重要です。

最近、中国科学院蘇州ナノテクノロジー・ナノバイオニクス研究所の張志軍教授のチームは、NSCを搭載した神経組織の足場を製造するために使用できる3Dバイオプリンティング戦略を開発しました。印刷された足場は、NSC の成長と神経分化に良好な微小環境を提供し、軸索再生を促進し、グリア瘢痕形成を減らし、神経ネットワークの形成を最適化し、最終的に SCI モデルラットの運動能力を回復し、SCI 修復を達成するのに役立ちます。関連する成果「脊髄損傷修復のための 3D バイオプリント神経組織構造」が Biomaterials に掲載されました。

図1 3Dプリント前後のHBC/HA/MAバイオインクの架橋反応とNSC搭載神経組織スキャフォールドの3Dバイオプリントの模式図

バイオインクの成分: ヒドロキシプロピルキトサン (HBC)、チオール化ヒアルロン酸 (HA-SH)、ビニルスルホン化ヒアルロン酸 (HA-VS)、マトリゲル (MA)

プロセス: HBC/HA-SH/MA および HA-VS 溶液を氷浴で混合し、HBC/HA/MA-0.3 バイオインク (HBC 3% w/v、HA-SH0.3% w/v、HA-VS 0.3% w/v、MA 0.1% w/v) または BC/HA/MA-0.6 バイオインク (HBC 3% w/v、HA-SH0.6% w/v、HA-VS 0.6% w/v、MA 0.1% w/v) を得ました。 HBC/HA/MA バイオインクを 37°C で 2 時間放置して、架橋 HBC/HA/MA ハイドロゲルを形成しました。NSC と HBC/HA/MA バイオインクを混合し、氷浴に 5 分間置いて、細胞を含んだバイオインクを得ました。

3Dバイオプリンティング条件：押し出しバイオプリンティング法、シリンジ温度10°C、印刷プラットフォーム温度37°C、印刷圧力約20kPa

1. HBC/HA/MAバイオインクの特性

1) せん断減粘特性、ゲル化速度、機械的強度の特性評価
HBC/HA/MA バイオインクは典型的なせん断減粘挙動を示します。低温でも流動性が良く、37℃に加熱するとすぐにハイドロゲルに架橋します。 HBCとHBC/HA/MAのゲル化時間（弾性率G'=損失弾性率G"となる時間）を比較すると、同じ濃度のHBCとHBC/HA/MAバイオインクは同様のゲル化時間を示しており、HBCがHBC/HA/MAバイオインクの急速なゲル化に大きな役割を果たしていることがわかります。また、HBC/HA/MAハイドロゲルの機械的強度は、化学結合のないHBCやHBC/HA/MAハイドロゲルの機械的強度よりも大幅に高く、一定の範囲内でHA濃度に比例します（図2）。

2) 膨潤速度、安定性、形態構造の特性評価研究者らは走査型電子顕微鏡（SEM）を使用してHBC/HA/MAハイドロゲルの形態構造を観察し、ハイドロゲルの内部は比較的均一なサイズ（約100μm）の高多孔質構造であり、孔サイズは一定の範囲内でHA濃度に反比例することを発見しました。また、膨潤率分析とin vitro分解試験を通じて、HBC/HA/MAハイドロゲルの膨潤率と分解挙動を観察しました。 HBC/HA/MA ハイドロゲルの膨潤率は HBC ハイドロゲルよりも低いことがわかりましたが、細胞培養に関連する平衡水分含有量には大きな影響はありませんでした。さらに、架橋度の高いハイドロゲルは安定性が高く、分解されにくいという特徴があります (図 2)。

図2 HBC/HA/MAバイオインクの関連特性

2. NSCを搭載した3DプリントHBC/HA/MAスキャフォールドの準備と関連試験
研究者らは、NSC を含む HBC/HA/MA バイオインクを使用して正方形グリッドのスキャフォールドを準備し (スキャフォールドの微細構造は印刷プロセス中に変形したり崩壊したりしなかった)、Live/Dead アッセイを使用してスキャフォールド内の NSC の生存率を評価し、細胞の生存率と増殖能力が高いことを発見しました。 SEM の結果では、スキャフォールドに付着した NSC が 7 日間の培養後に完全に伸び、糸状仮足が豊富な細胞間接続を形成したことが示されました。また、研究者らは、バイオプリンティング後のNSCの分化能力を免疫蛍光染色法で研究しました。その結果、足場中の細胞がアストロサイトマーカーGFAPとニューロン特異的細胞骨格タンパク質Tuj1を発現し、成熟ニューロンに分化できることが分かりました。また、足場中のHA濃度がNSCのニューロン分化に重要な影響を及ぼし、HBC/HA/MA-0.3足場中のNSCの方が分化率が高いことも分かりました（図3）。

図3 NSCを搭載したHBC/HA/MAスキャフォールドの関連試験

3. SCIラットの治療のためのNSCを搭載した3Dプリント線形アレイ状足場
1) 運動機能評価研究者らは、自然な脊髄白質構造を模倣したNSC搭載リニアアレイスキャフォールド（以下、総称してNSC搭載スキャフォールド）を印刷し、T8-9で脊髄を完全切断した脊髄損傷モデルラットの脊髄切断部位にスキャフォールドを移植した。最後に、NSCを充填したスキャフォールド（治療用量：3×105）、空のスキャフォールドを移植したグループ、および未治療のグループのラットの後肢の筋肉と関節の動きを、Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）テストと柔軟な圧力センサーによるリアルタイムモニタリングによって評価しました。対照群のラットと比較して、後肢の明らかな動きは観察されなかったことが判明した。 NSC を搭載したスキャフォールドを移植されたラットは、運動機能の顕著な回復を示し、同時に股関節、膝関節、足首関節の動きも回復しました。 NSC を充填したスキャフォールド移植の SCI 修復効果は、空のスキャフォールド移植群および対照群よりも優れていました (図 4A-E)。

2) 組織学的分析 NSCを充填したスキャフォールドのSCIに対する治療効果をさらに研究するため、研究者らはスキャフォールド移植後12週間で各マウス群の損傷した脊髄の組織学的分析を行った。免疫蛍光染色によりニューロン、軸索、オリゴデンドロサイトの再生を検出し、脊髄の損傷部位における神経線維の成長とミエリン形成を研究した。結果：NSCを負荷したスキャフォールド移植群の病変部では、Tuj1、NF、Oligo2、GAP-43、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）の明らかな陽性染色が観察されたが、GFPAの発現は低かった。これは、NSCを搭載したスキャフォールドが軸索とミエリン形成、神経分化を促進し、損傷部位でのグリア瘢痕形成を阻害したことを示しています（図4F）。

3) 移植後の NSC の生存と分化研究者らは GFP-NSC を搭載した足場を準備し、それを病変部に移植しました。その後、移植後 12 週間でサンプルを採取し、免疫蛍光染色を行って、体内での外来 NSC の運命をモニタリングしました。結果は、スキャフォールドを移植した NSC は少なくとも 12 週間生存できることを示しており、GFP の局在はほとんどの Tuj1、NF、および Oligo2 の局在と一致しており、生存した NSC が Tuj1 陽性ニューロンと Oligo2 陽性オリゴデンドロサイトに分化したことを示唆しています。 GFP 抗体で共染色されなかったニューロンとオリゴデンドロサイトの存在は、内因性 NSC が損傷領域に移動して損傷の修復に関与する可能性があることを示唆しています。これらの結果はすべて、NSC を搭載したスキャフォールドが NSC にとって良好な微小環境を提供することを示しています (図 4G-H)。

図4 SCIラットの脊髄損傷修復を促進するためのNSC搭載スキャフォールド移植の評価

4. 結論
HBC/HA/MA ハイドロゲルは、NSC の成長に適した分解速度、多孔性、機械的強度を備えています。 HBC/HA/MA ハイドロゲルを使用して調製された NSC 搭載スキャフォールドは、NSC にとって良好な微小環境を提供します。スキャフォールド内の NSC は、高い生存率、強力な増殖能力、および良好な神経分化能力を備えています。 NSC を搭載したスキャフォールドの移植は、脊髄損傷領域での軸索とミエリン形成を促進し、グリア瘢痕の形成を抑制し、SCI ラットの運動機能を大幅に改善することができます。この 3D バイオプリントされた NSC 搭載スキャフォールドは、神経組織工学やその他の再生医療分野での使用が期待されています。

ソース：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120771

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