骨格筋組織工学のための高度に組織化された構造を作成するための押し出しベースの 3D バイオプリンティング

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

3D バイオプリンティングは組織工学材料の構築に関わる新興技術であり、さまざまな印刷システムが開発されています。その中で、押し出しベースのアプローチは、並行モードで印刷された繊維を生成および堆積できるため、骨格筋組織工学に最も適していることが証明され、ネイティブの骨格筋組織構造をよく模倣します。しかし、この機能は、細胞接着や吸収の動機など、細胞の要件とはあまり相関しないことがよくあります。

この障害を克服するために、ローマ大学生物学部の C Gargioli 氏とフランスのエクス・マルセイユ大学の S Testa 氏のチームは、新しい押し出しベースの 3D バイオプリンティングシステムの開発と特性評価、およびマウスモデルの体積筋喪失 (VML) 損傷の矯正へのその応用について報告しています。 PEG フィブリノーゲンの使用により、高度に組織化された 3D 構造が得られ、マウスの筋肉前駆細胞は、整列した束に配列された筋線維に分化し、in vitro で培養すると自発的に収縮できるようになりました (図 1)。

関連する研究成果は、「骨格筋組織工学のための新しい押し出しベースの3Dバイオプリンティングシステム」というタイトルで、2023年2月3日に「Biofabrication」に掲載されました。

図1 3Dバイオプリンティングとバルク重合プロセスの概略図
1. バイオプリントおよびバルク構造における筋線維の成熟、組織化、および均質性のin vitro分析

細胞接着、増殖、分化などの生物学的プロセスを維持する印刷システムの有効性を、マウス中胚葉血管芽細胞 (Mabs) を使用して評価しました。モノクローナル抗体は、天然素材と合成素材の両方の利点を兼ね備えた光硬化性ハイドロゲルである PF で構成されたバイオインクに添加されました。得られたバイオプリント構造は、完全に分化した筋線維を得るために最大 30 日間培養されました (図 2A)。単一のけいれんの収縮段階で発生する変位を示す放射状変位は、バイオプリントされた条件では有意に高く（2.5 倍）なりました（図 2B）。さらに、バイオプリント構造では印刷軸と平行であるのに対し、バルク構造ではランダムに配向するなど、異なるけいれんの方向性が観察されました（図2B）。

図2 細胞化構造体における筋分化の経時的変化の明視野画像筋分化後30日目に、バルク構造体とバイオプリント構造体を、筋分化マーカーMyHCとデスミンの全載免疫蛍光分析によって分析した（図3A）。画像解析により、PF が Mabs の維持に好ましい微小環境を提供し、両方の条件下で Mabs が増殖して融合し、大きな多核筋線維を生成することが確認されました (図 3B)。バイオプリント構造における筋線維の組織化と寸法の均一性の向上の証拠は、2つの条件間の筋線維の幅、長さ、および一貫性を比較することによって評価されました（図3C）。体積曲線と比較すると、バイオプリント構造の幅の分布はより大きなサイズにシフトし、よりシャープになっていることがわかります（図3C）。さらに、バイオプリント構造の筋線維の平均長さは、バルク筋線維と比較して大幅に長く（2 倍）、オフセット長さの分布によっても確認されました（図 3D）。

図3 バルクおよび3Dバイオプリント構造の免疫蛍光分析
2. 構造分化と繊維配列の解析<br /> バルク構造とバイオプリント構造の両方を急速冷凍し、OCT 鋳造で凍結切片を取得しました。免疫蛍光分析により、両方の条件でデスミン陽性およびMyHC陽性筋線維の存在が確認されました（図4A）。細胞は独自の細胞外マトリックス（ECM）を生成することができ、繊維を囲むラミニンの存在によって証明され、細胞が成熟したことを示しました（図4A）。

細胞密度は、スライス内の細胞の存在と局在を示す測定値であり、バイオプリント構造では有意に高く、筋線維のより良い分布を反映しているのに対し、バルク構造では細胞は主に最外層に位置していた（図4B）。さらに、バイオプリント条件下では、構造体の断面で測定された円形度と断面積はそれぞれ高く、低くなっており、構造体の縦軸に沿った筋線維の配列が良好であることを示しています (図 4C)。一方、バルク構造体では、筋線維が一方向に配向されていなかったため、予想どおり断面積は大きくなりましたが、円形度は低くなりました (図 4D)。

図4 構造断面解析
3. マウスへのバイオプリント構造の移植後のTA容積回復<br /> 最後に、著者らは VML マウスモデルを使用して、再生医療への応用における印刷システムの可能性を評価しました。バイオプリントされた構造物は、30 日間宿主の筋肉内に埋め込まれ、統合されました。対照マウスでは、TA 筋組織は除去されましたが、人工構造物に置き換えられませんでした。移植された TA の組織領域は対照群と比較して完全に修復されましたが、対照群では組織の修復が不十分で不十分でした (図 5A)。再構成組織の中心核筋線維内に多数のLacZ陽性核が標識されており、良好な組織化が実証されている（図5B）。
図 5 切除および移植されたマウス TA の免疫蛍光分析移植された構造物から再構築された組織は、平滑筋アクチン (SMA) とフォンヴィレブランド因子 (vWF) の陽性シグナルを示す LacZ 陽性核が豊富な領域によって強調され、それぞれ血管筋壁と内皮細胞を示すことから、適切に血管新生していることが実証されました (図 6A)。さらに、LacZ陽性核を示す再構成筋線維は、リン酸化神経フィラメント（pNF）およびα-ブンガロトキシン（BTX）免疫染色によるシナプス前およびシナプス後構造の陽性標識によって実証されるように神経支配されており、3D構造体の移植後に再生されたTA筋内で神経筋接合部の発達を実証している（図6B）。 nLacZMabsで再構築されたTA領域ではPax7陽性サテライト細胞が観察され、筋肉再生に必要な幹細胞ニッチが再構築されたことが示された（図6C）。

図6 3Dバイオプリント構造におけるnLacZ-Mab再生領域の高倍率分析
4. バイオプリント構造を人体に移植した後の TA 体積回復<br /> 提案されたアプローチを人間の研究に適用できる可能性を評価するために、hMSC を搭載した筋肉由来のバイオプリント構造物を利用したパイロット実験が実施されました。上記の実験と同様に、TA 筋肉の 50% を切除した後、ヒト細胞を含む構造体をマウスの後肢に移植しました。摘出されたTAの断面には2つの異なる領域が見られ、1つは宿主の本来の筋肉であり、もう1つはヒトバイオプリントインプラントに由来する領域であった（図7A）。異種移植片によって形成された組織は、マウス由来の移植片と比較して全体的に組織化されていないように見えましたが、多くのヒトラミンA/C（Lam A/C）陽性核と共局在する大きなMyHC陽性領域は、再構成された筋肉組織がヒト由来であり、hMSCが宿主の除去されたTAと統合する筋線維を生成できることを示しました（図7B）。

図 7 hMSC を搭載したバイオプリント構造を移植したマウス TA 断面の免疫蛍光分析再構成された TA 組織をより詳細に分析したところ、小さな横方向の筋線維を持つ組織領域がさらに多く存在し、連続切片では中心核化とラミン A/C 陽性であることが示されました (図 8A)。ヒト由来のインプラントから再構築された組織も、血管（SMAおよびvWF）および神経特異的（pNFおよびBTX）マーカーによって明らかにされた陽性シグナルによって強調されるように、適切な血管新生および神経支配を示しました（図8B-C）。さらに、いくつかの繊維の周辺にはPax7陽性衛星細胞の存在が観察され、再構成されたTAには再生能力があることが示唆された（図8D）。

図 8 ヒト細胞由来の再構成された TA 領域の高倍率分析この研究では、細胞足場を構成するハイドロゲルとして PF のみを使用することで構築された、提案された PF ベースのアルギン酸フリー押し出し 3D バイオプリンティングシステムが、骨格筋組織工学のための新しく競争力のあるツールであることが実証されました。提示された結果は、この革新的な印刷アプローチが 2 つの主な側面で持つ可能性を浮き彫りにしています。一方では、自発的な収縮が可能な適切に組織化された筋線維を示す生体外生物学的代替物を得る可能性が示され、これは薬物スクリーニングやミオパシー研究のための生物学的プラットフォームとなる可能性があります。他方では、マウスモデルで印刷された構造物が VML 損傷を修復する際の有効性 (マウスとヒト由来の筋原前駆細胞の両方を含む) は、提案されたアプローチが再生医療のための注目に値する効果的なツールとなる可能性があることを示唆しています。

ソース：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb573

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