上海大学の蘇佳燦氏：機能的な骨オルガノイドを構築するための 3D プリントされた GelMA/AlgMA/ハイドロキシアパタイトスキャフォールド

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

大きな骨欠損の管理は、自己治癒能力の固有の限界によりリハビリテーションが長期化し、再生が最適ではなくなるため、依然として大きな課題となっています。現在、臨床的な解決策は存在しますが、重大な欠点があり、骨再生にはより効果的なアプローチが必要です。幹細胞由来のオルガノイド構造はこの分野で大きな可能性を示していますが、骨オルガノイド構造の開発は、足場やハイブリッド細胞外マトリックス (ECM) によって提供される堅牢な機械的サポートの必要性など、特定の要件によって制限されています。このような状況において、バイオプリンティング技術は骨組織の複雑な構造を複製する強力な手段として登場しました。

上海大学の蘇佳燦氏が率いるチームと上海第六人民病院の石忠民氏が率いるチームは、新しいタイプのバイオインク（GelMA/AlgMA/ハイドロキシアパタイト）を使用して、非常に複雑な骨細胞外マトリックスの模倣物を製造する方法を開発した。バイオプリントされた足場は、大規模なバイオプリントされた骨オルガノイド構造の長期培養と段階的な成熟を促進し、多細胞分化を促進し、骨形成の初期段階に関する貴重な洞察を提供します。この研究におけるバイオインクの固有の自己石灰化特性は天然骨の特性と非常によく似ており、オルガノイド構造に強化された骨修復能力を与え、in vitro および in vivo の両方の用途に適しています。この画期的な研究は骨組織工学の分野を前進させ、それを実際の応用に応用できる大きな可能性を秘めています。関連研究は、2024年4月20日にトップクラスの国際ジャーナルであるAdvanced Materialsに「骨マトリックスにヒントを得たハイドロキシアパタイトハイブリッドバイオインクによる大規模な自己石灰化骨オルガノイドの設計」と題する論文として掲載されました。

1. 革新的な研究内容<br /> この研究では、ハイドロキシアパタイトとゼラチンメタクリレートやアルギン酸メタクリレート（GelMA/AlgMA）などの有機ポリマーを組み合わせることで、骨の複雑な細胞外マトリックス（ECM）を模倣するバイオインク配合が開発されました。得られたバイオインクは、独自の自己石灰化機能と細胞分化機能を備えています。これらの構造は、骨オルガノイドの足場をバイオプリントするために使用された場合、機能的な機械的サポート、長期細胞培養、および in vitro と in vivo の両方での自己石灰化能力を実証しました。注目すべきことに、生体内培養により、バイオプリントされたオルガノイド構造は紡錘形の骨のような構造に進化し、骨オルガノイド構造の成熟度の高さと天然の海綿骨との機械的類似性を示しています。 GelMA や GelMA/AlgMA などの有機バイオインクは骨器官のような構造を形成できないことに注意する必要があります。この画期的な研究は、骨オルガノイド足場をバイオプリントするためのハイブリッドバイオインクの調製に初めて成功したことを示し、骨オルガノイド構造の発達における無機成分の重要性を強調し、骨発達の初期段階における分化とマトリックス形成に関するさらなる研究への道を開きます。合成骨マトリックスからヒントを得た自己石灰化特性を持つバイオインクにより、天然骨組織の構造、機能、再生能力を厳密に模倣した人工骨オルガノイド構造が可能になります。この進歩の影響は、疾患モデル化、薬物スクリーニング、個別化医療、再生医療など、骨組織工学のさまざまな応用に及んでいます。

バイオインクと印刷された足場の特性評価
これらのバイオインクは優れた印刷性を示し、数ミリメートルの寸法でもウサギモデルを含む詳細なモデルを高い印刷精度で作成することができました。多孔質印刷能力を評価するために、本研究では多孔質スキャフォールドを印刷しました。上面図の分析から、50 μm の孔サイズでもすべての孔が一貫して印刷されていることがわかります。この研究では、栄養素の供給と細胞の成長を促進するという利点のある多孔質構造を持つ代表的な円筒形スキャフォールドが、その後の生物学的実験のために選択されました（図1A）。走査型電子顕微鏡画像により、印刷されたスキャフォールドが細胞キャリア用途に適した精密な多孔質構造を有していることが確認されました。さらに、GelMA/AlgMA/HAPでプリントされたスキャフォールドの表面にはCa/P元素が見られました（図1C）が、GelMAおよびGelMA/AlgMAスキャフォールドにはCa/P元素は見られませんでした。本研究では、凍結乾燥後のハイドロゲルの形態変化を軽減するために、クライオ走査型電子顕微鏡による観察を行った。 GelMA/AlgMA/HAP ハイドロゲルは、より均一な微細孔構造を示しました。これは骨芽細胞の石灰化とナノからマイクロスケールの骨梁の構築に有益です（図1B）。ハイドロゲルの圧縮弾性率は、弾性領域、特に初期の線形部分における応力-ひずみ曲線の勾配を分析することによって決定されました。特に、GelMA/AlgMA/HAPバイオインクを使用したグループは、GelMAのみを使用したグループよりも大きな骨折ひずみを示しました（図1D）。複合ハイドロゲルの圧縮強度と圧縮弾性率はそれぞれ50 kPa/0.09 MPa、57 kPa/0.12 MPa、170 kPa/0.40 MPaであり、GelMA、GelMA/AlgMA、GelMA/AlgMA/HAPに相当します（図1E-F）。 AlgMA の導入により、GelMA ハイドロゲルと比較して圧縮強度と弾性率が向上しましたが、その差は統計的に有意ではありませんでした。さらに、GelMA/AlgMA/HAP の圧縮弾性率は約 400% 大幅に増加しました (図 1F)。

図 1 合成された GelMA、GelMA/AlgMA、GelMA/AlgMA/HAP バイオインクとそれに対応するスキャフォールドの分析と評価 [3D バイオプリントされたスキャフォールドは、in vitro で長期の細胞培養を維持できます]

人工組織スキャフォールド、特に細胞をカプセル化するスキャフォールドでは、細胞の良好な生存、付着、増殖を確保することが非常に重要です (図 2)。骨髄間葉系幹細胞（BMSC）をバイオインクに封入し、足場の形状に印刷しました（図2A）。生細胞/死細胞アッセイの結果は、すべてのグループの細胞が14日間の培養期間を通じて良好に生存したことを強く実証し、バイオインクがBMSCの長期生存性を維持できることを検証しました（図2C-D）。最初の印刷中、細胞はバイオインク内に均等に分散され、個別のドットとして表示されます。しかし、時間が経つにつれて、注目すべき現象が観察されました。 BMSC はスキャフォールドの表面に移動し、徐々に増殖して存在を拡大し、最終的に複雑な 3 次元細胞ネットワークを形成します。これらの細胞ネットワークは、培養 7 日後には細胞骨格の拡大を伴い、ますます顕著になりました。これらの強力な観察結果は、生体外で徐々に分解する一方で、バイオプリントされた足場は構造的に安定したままであり、BMSC の培養をサポートできることを強調しています。 CCK-8アッセイの結果もこれらの所見を確認した（図2B）。全体として、この研究は、3D バイオプリントされた細胞キャリアスキャフォールドが長期培養中に細胞の生存と成長を効果的に促進し、骨器官のような構造の形成の基礎を築くことを強調しています。

図 2 骨髄間葉系幹細胞 (BMSC) を搭載したバイオプリント GelMA、GelMA/AlgMA、および GelMA/AlgMA/HAP スキャフォールドの生体適合性評価 [in vitro 3D バイオプリントスキャフォールドは骨形成分化を促進する]

この研究では、バイオプリントされたスキャフォールドの長期細胞培養の可能性を実証した後、複雑な骨器官のような構造を形成する幹細胞キャリアとして機能する能力を評価するための重要な検証ステップを実施しました。異なるグループの骨形成能をさらに評価するために、40 日間の in vitro 培養後にスキャフォールドをアルカリホスファターゼ (ALP) とアリザリンレッド (ARS) で染色しました。 ALP 染色では、GelMA/AlgMA/HAP グループの ALP 発現が最も高いことが示されました。 ARS 染色を使用して、さまざまなスキャフォールド内の BMSC の石灰化レベルを調査しました。 ARS はカルシウムと橙赤色のキレートを形成し、骨の石灰化の指標として機能します。 GelMA と GelMA/AlgMA は、アリザリンレッド染色において最も低いカルシウムまたはリン含有量を示しました。対照的に、GelMA/AlgMA/HAPでは明らかなカルシウムとリンの沈着が見られ、石灰化した結節も増加しました（図3A）。 14日間のin vitro培養後、ALPおよびARS活性を測定することでBMSCの骨芽細胞への分化を定量的に評価しました。 GelMA/AlgMA/HAP群のALP活性とARS活性はそれぞれ2.01 ± 0.14と1.74 ± 0.11であり、GelMA群の約6倍と9倍高かった（図3B–C）。この研究では、足場を溶解し、得られた細胞をRT-PCRでさらに評価しました。 RT-PCR解析の結果、Runx2、Col1A1、OCN、OPNなどの骨形成関連遺伝子の発現レベルは、GelMA/AlgMA/HAP群では他の2群と比較して有意に増加していることが示された（図3D）。 GelMA/AlgMA 群と GelMA 群を比較すると、Runx2、OCN、OPN の発現レベルに有意差はありませんでした。しかし、Col1A1の発現レベルはGelMA群と比較してGelMA/AlgMA群で有意に増加しており、AlgMAがコラーゲン産生を促進したことを示唆している。骨形成関連タンパク質の発現をさらに検証するために、免疫ブロット分析を実施しました。免疫ブロット法の結果、GelMA/AlgMA/HAP群における骨芽細胞関連タンパク質（Runx2、BMP-2、OCN）の発現は、GelMA群およびGelMA/AlgMA群よりも有意に高かったことが示された（図3E）。これは、GelMA/AlgMA/HAP が遺伝子レベルで骨形成を促進するだけでなく、タンパク質レベルでも骨形成関連タンパク質の発現を高めることをさらに証明しています。さらに、画像では、GelMA で印刷されたスキャフォールドの境界がより明確であるのに対し、GelMA/AlgMA/HAP で印刷されたスキャフォールドの境界はよりぼやけており、細胞が GelMA/AlgMA/HAP バイオインク内で成長し、拡大したことを示しています。これらの発見は、骨オルガノイド構造を形成する GelMA/AlgMA/HAP バイオインクが骨形成分化と組織リモデリングを誘導できることを示唆しています。

図3 バイオプリントされたGelMA、GelMA/AlgMA、およびGelMA/AlgMA/HAPスキャフォールドは、in vitroで骨形成能が向上しています[骨オルガノイドのin vitro自己石灰化]

40 日間の培養中に、マイクロ CT モニタリングを使用して、バイオプリントされた足場の in vitro ミネラル形成と成熟を調査しました (図 4)。この研究では、バイオプリントされたスキャフォールドの3つのグループをin vitroで20日間と40日間培養し、マイクロCTを使用してin vitroの石灰化を研究しました（図4A）。マイクロCT画像では、20日目と40日目にGelMA、GelMA/AlgMA、GelMA/AlgMA/HAPのミネラル形成が示されました（図4F-G）。 40 日間の培養期間中、GelMA と GelMA/AlgMA ではほとんどミネラル形成が見られませんでしたが、GelMA/AlgMA/HAP では広範囲にわたるミネラル沈着が見られました。したがって、GelMA/AlgMA/HAP バイオプリントスキャフォールドを 40 日間 in vitro で培養すると、骨器官のような構造になることが確認されました。最初の 20 日間は、主に足場の外側で鉱化が起こりました。しかし、20日後には、鉱化は足場の内部まで拡大しました。側面から見ると、石灰化組織は内部よりもスキャフォールド表面でより均一に成長していることが示されました。対照的に、他の 2 つのグループでは、一定期間が経過しても完全な足場構造は示されませんでした。 20 日から 40 日の期間中、GelMA と GelMA/AlgMA ではわずかな石灰化スポットしか現れず、これらのグループでは自己石灰化プロセスが主に 20 日以降に発生したことを示しています。 HAP の効果を評価するために、細胞を負荷しないスキャフォールドで構成される対照群も設定されました。しかし、これらの物質は BMSC が存在しない状態では石灰化できず、十分な膨張平衡後もマイクロ CT 下で高密度の信号は示されませんでした。 20日間浸漬した後、BMSCsを添加していないGelMA/AlgMA/HAPは自己石灰化しませんでした。この研究では、総ミネラル量（TMV）とオルガノイドミネラル密度（OMD）も経時的に定量化されました（図4B-C）。 20 日目には、GelMA/AlgMA/HAP グループの TMV は他のグループよりも有意に高かったが、GelMA グループと GelMA/AlgMA グループの間には有意差は認められなかった。

図4 GelMA、GelMA/AlgMAバイオプリントスキャフォールド、およびGelMA/AlgMA/HAPバイオプリント骨オルガノイド構造は、in vitroで自己石灰化を示す[in vivoでの骨オルガノイドの形成と自己石灰化]

生体内で大きく成熟した骨組織に再構築する能力をさらに調査するために、本研究では、ヌードマウスの皮下移植による生体内での骨オルガノイド構造の形成への応用を検証しました。生体内の細胞増殖微小環境をより正確にシミュレートするために、3D バイオプリントされたハイドロゲルスキャフォールドを 3 日間の生体外培養後にヌードマウスの皮下に移植しました。スキャフォールドの自己石灰化と骨オルガノイド構造の形成を異なる時点で評価した（図5A）。 HE 染色した組織切片を使用して、バイオプリントされたスキャフォールド内にさまざまな細胞タイプが存在することがわかりました (図 5B)。これは、BMSC の効率的な分化を示しています。 GelMA と GelMA/AlgMA の両方において興味深い発見は、特にスキャフォールドの中央領域において、特定の領域が比較的無傷のまま残っており、細胞が不足していることを示していることでした。これらのグループでは、細胞は主に足場の端に分布していました。対照的に、GelMA/AlgMA/HAP では、細胞がスキャフォールド全体に均一に広がる驚くべき能力を示しました。この研究では、OCN、OPN、Runx2 などの主要な骨関連因子と骨マトリックスの重要な成分に対する特異的免疫染色を実施しました。これらの分析により、GelMA/AlgMA/HAP グループに強力な骨形成能力があることが明らかになり、GelMA/AlgMA/HAP が皮下骨の発達をサポートする能力があることが強調されました。対照的に、GelMAおよびGelMA/AlgMAでは、OPNおよびRunx2の発現は主に培養40日後に増加した（図5C）。重要なのは、20 日時点で、これらのグループの OPN と Runx2 の発現レベルが GelMA/AlgMA/HAP 骨オルガノイドよりも大幅に低かったことです。免疫組織化学の定量的データにより、GelMA および GelMA/AlgMA と比較して、GelMA/AlgMA/HAP では骨形成タンパク質 (OCN、OPN、および Runx2) の発現が有意に増加していることが示されました (図 5D-F)。

図 5 GelMA、GelMA/AlgMA バイオプリントスキャフォールド、および GelMA/AlgMA/HAP バイオプリント骨オルガノイド構造は、生体内での骨形成能力が向上しています。定量的データにより、この研究の視覚的観察が確認されました。 BMSCの分化をさらに確認するために、コラーゲンII、脂肪組織、ペリオスチンなどのマーカーの免疫蛍光染色を行った（図6A-B）。 GelMA/AlgMA/HAP における危険な脂肪組織 + 細胞とペリオスチン + 細胞の存在により、脂肪組織と骨芽細胞の存在が確認されました。対照的に、他の 2 つのグループでは、これらの違いは 20 日目と 40 日目にはほとんど観察されませんでした。 GelMA/AlgMA/HAP の免疫蛍光染色の結果、コラーゲン II が陽性であり、軟骨細胞の存在が示されました。生体内培養20日間と比較して、40日目の蛍光強度は有意に弱く、GelMA/AlgMA/HAPにおける骨化は軟骨内骨化を介して進行する可能性があることを示唆しており、定量的蛍光データによってこれらの観察結果が確認されました（図6C-E）。

図 6 GelMA、GelMA/AlgMA バイオプリントスキャフォールド、および GelMA/AlgMA/HAP バイオプリント骨器官様構造が体内で形成され、多細胞分化能力を示しました。免疫蛍光染色の結果に基づいて、本研究では、体内で 20 日間培養された GelMA/AlgMA/HAP バイオプリントスキャフォールドを「骨器官様構造」と表現しました。この研究では、ハイドロゲルスキャフォールドを 3D プリントし、ヌードマウスの皮下に移植して、それぞれ 20 日間と 40 日間培養しました。その後、マイクロ CT を実行して、生体内での自己石灰化を調べました (図 7A)。ハイドロキシアパタイトバイオプリントスキャフォールドは、40日間の生体内培養後も構造を維持し、白い骨のような構造に発達しました（図7D-E）。対照的に、GelMA と GelMA/AlgMA は軟骨のような構造を示しました。さらに、GelMA/AlgMAおよびGelMA/AlgMA/HAPの表面には、GelMAよりも多くの血管が存在しました。バイオプリントされたスキャフォールドの石灰化と骨量はマイクロCTを使用して評価されました（図7F）。マイクロ CT 再構成により、GelMA/AlgMA/HAP バイオプリント骨オルガノイド構造が石灰化していることが明確に示され、特に 20 日間の生体内培養後には骨様マトリックスが辺縁領域にさらに蓄積されました。対照的に、他の 2 つのグループでは石灰化は見られませんでした。 40日間培養した後、多孔質構造を含むGelMA/AlgMA/HAPプリント骨オルガノイドの全体構造をマイクロCTで観察した（図7G）。この研究では、生体内自己石灰化研究において、TMV と OMD の経時的な変化を定量化しました。 20日目と40日目では、GelMA/AlgMA/HAPのTMVとOMDは他のグループよりも有意に高かったが、GelMAとGelMA/AlgMAの間には有意差は見られなかった（図7B-C）。

図7 GelMA、GelMA/AlgMAバイオプリントスキャフォールド、およびGelMA/AlgMA/HAPバイオプリント骨オルガノイド構造は、生体内で自己石灰化を示す
2. まとめと展望

結論として、この研究では、GelMA/AlgMA/HAP バイオインクで BMSC を使用して大規模な 3D 骨オルガノイド構造をバイオプリントすることに成功しました。これらのバイオインクは、カプセル化された BMSC に好ましい環境を提供し、その活性機能と自己石灰化を促進します。生体内環境では、これらのバイオプリントされた骨オルガノイド構造は、骨形成、石灰化、細胞層形成、可塑性、およびリモデリングを効果的に誘導し、最終的に骨オルガノイド構造の発達を促進しました。本研究で構築した骨オルガノイド構造は、実際の骨組織、特に海綿骨と比較して、海綿骨に類似したマイクロおよびナノスケールの多孔質構造と明確なハイドロキシアパタイト結晶相を持ち、包括的な構造シミュレーションを実現しています。機械的特性の面では、現在のハイドロゲル構造と比較して、本研究では構築された骨器官様構造の機械的強度が3桁増加し、SDラットの皮質骨と有意に変わらないGPaレベルに達しました。興味深いことに、組織透明化技術により、本研究で構築された骨オルガノイド構造はネットワーク状の血管腔を形成しました。この研究は、GelMA/AlgMA/HAP 骨オルガノイド構造を使用して、3D バイオプリンティングによる骨修復のための機能化され簡素化されたバイオフレームワークを作成する可能性を強調しています。骨オルガノイド構造の構築における固有のニーズと課題を認識し、それに対処することで、研究者は適切なマトリックス材料とバイオインクを選択する際に情報に基づいた選択を行うことができ、それによって骨組織工学と再生医療の境界を押し広げることができます。骨の微小環境の複雑さへの取り組みが続けば、将来的には、幹細胞の行動のさまざまな側面を正確に制御できる大規模で機能強化された骨オルガノイド構造を設計することが可能になり、骨組織の再生における生体材料の応用が進む可能性があります。

ソース：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202309875

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