骨格筋組織工学における3Dバイオプリンティングの応用

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

骨格筋組織工学は、病気、事故、または重大な手術により損傷を受けた、または機能の一部を失った骨格筋を置換または修復することを目的としています。これは、患者の体から採取した筋原性前駆細胞または幹細胞を培養し、直接培養するか、または足場に取り付けて、患者の体に移植できる機能的な骨格筋を準備することによって実現されます。骨格筋組織工学は、再生医療だけでなく、バイオロボティクス、細胞ベースの分析、バイオセンシング、エネルギーハーベスティング、薬物スクリーニングなどにも幅広く応用されています。しかし、既存の組織工学手法を使用して筋肉の複雑さを再現する方法は、依然として課題となっています。

米国カリフォルニア大学のアリ・カデムホセイニ教授のチームは、Small誌に「骨格筋組織工学における3Dバイオプリンティング」と題するレビュー記事を発表した。このレビュー記事では、骨格筋の解剖学的構造について簡単に説明し、印刷プロセス、インクの配合と性能、および表面実装技術におけるバイオ3Dプリンティング技術の進歩の観点から、骨格筋組織工学におけるバイオ3Dプリンティング技術の応用について概説した。

人体には 600 種類以上の骨格筋があり、体重の約 45% を占めています。骨格筋は骨を支え、さまざまな動きの安定性と協調性を維持し、代謝を調節するために連携して働いています。骨格筋の解剖学的構造を図1に示します。骨格筋は収縮能力を持つ筋細胞または筋線維で構成されています。筋線維は結合組織の薄い層に包まれ、軸方向に配置されて束を形成しています。外側は結合組織で覆われ、互いに接続されています。骨格筋は、栄養素を受け取り老廃物を除去する血管網、活性化して収縮する神経網、腱を介して骨にも接続されています。

図1 骨格筋の解剖学的構造

研究状況骨格筋細胞の分化を改善し、高機能筋組織を得るために、特定の形態特性、硬度、導電性、ポリマー組成、可溶性因子を備えたスキャフォールドが開発されています。さらに、骨格筋細胞と線維芽細胞を共培養して筋腱接合部を作製したり、内皮細胞と共培養したりすることで、血管新生した筋肉が得られました。人工筋肉の機能をさらに向上させるために、研究者たちは体内の骨格筋の構造と微小環境を模倣する研究を行っています。すべての従来のアプローチに共通するのは、筋肉細胞を整列させて筋形成を促進できるように異方性足場を製作することです。しかし、これらのアプローチでは、正確な 3D 空間細胞組織を誘導する上で限界があります。図 2 に示すように、3D バイオプリンティング技術は、細胞とマトリックスの堆積において高精度を実現することでこれらの制限を克服し、複雑な構造を迅速に製造したり、神経細胞との神経筋接続を実現してより複雑な人工組織を作成したりすることを目指しています。

図2 従来の方法と生物学的3Dプリント法で作製された骨格筋組織。 a. 3D プリントされた腱リンク。 b. 電界紡糸技術を使用して腱の硬さを調整する。 c. 神経と筋肉の接続を制御するチップを設計します。 d. 3D プリントされたハイドロゲル構造上での筋肉と運動ニューロンの共培養。

バイオ 3D プリンティングの堆積戦略バイオ 3D プリンティングとは、細胞や材料を含む 3D 物理構造を作成するために使用できるテクノロジーを指します。図 3 に示すように、一般的な技術には、押し出し印刷、インクジェット印刷、レーザー支援印刷、ステレオリソグラフィーなどがあります。インクジェット印刷は、バイオインクを一滴ずつ沈着させる技術に基づいており、熱、圧電、静電、音響、流体力学、マイクロバルブなどのさまざまな動作メカニズムを使用してバイオインクの液滴を生成します。押し出し印刷では、空気圧または機械圧力を利用してバイオインクをノズルから押し出します。バイオインクの堆積は、プラットフォーム上でプリントヘッドを XY 方向にラスタースキャンすることによって行われ、プリントヘッドまたはステージが Z 方向に移動して、層ごとに配置できるようになります。レーザー支援印刷では、ガラスまたは石英のリボンを薄い金属層で覆い、バイオインクを充填します。レーザーパルスは金属膜の蒸発を誘発し、高圧の泡を形成してバイオインクの液滴を基板に向かって推進します。ステレオリソグラフィーでは、レーザーが感光性樹脂を点ごとに硬化させて 3D 構造を形成します。投影光ステレオリソグラフィー (DLP) に基づく 3D 印刷では、オン/オフを切り替えることでターゲットの投影された 3D 構造の平面全体を層ごとに固めることができる、個別にアドレス指定可能な数百万個のマイクロミラーで構成されるデジタルマイクロミラーアレイデバイスを使用します。 DLP は、ミクロン解像度の 3D 構造を印刷するための優れた速度、解像度、スケーラビリティ、柔軟性を提供します。

図3 バイオ3Dプリンティングの3つの主な戦略

バイオインクの配合骨格筋の 3D プリント用バイオインクの配合には、天然ポリマーと合成ポリマーが広く使用されています。天然ポリマーの中でも、アルギン酸カルシウムやフィブリンなどの架橋速度の速いハイドロゲルは、バイオインクとして直接使用したり、印刷プロセス中にサポート材料として使用したりして、安定性の低い生体材料の印刷性を維持してきました。アルギン酸塩、コラーゲン、ゼラチンなどの他の天然ハイドロゲルは、人工組織の物理的サポートと細胞サポート機能を提供するために広く使用されてきました。さらに、自己成長因子が豊富な血小板に富む血漿をアルギン酸バイオフィルムに充填して組織工学スキャフォールドを製造することで、血管新生が促進され、炎症が軽減され、幹細胞が補充され、心血管系および骨格筋組織の再生が促進されました。図 4 に示すように、過去 15 年間で、天然ポリマーの機械的特性を正確に調整するために、研究者はメタクリロイルなどのさまざまな化学官能基を開発し、天然ポリマーと結合させて、フリーラジカル重合によって光架橋できるようにしました。 GelMA、HAMA、PEGDA、SilMA、AlgMA、DexMA、CSMA などの急速に光架橋可能なハイドロゲル材料は、さまざまな混合配合により優れた生物学的特性を実現でき、さまざまな形状、濃度、機械的特性を持つ細胞を含んだハイドロゲル構造を印刷できます。さらに、細胞への栄養素の供給は、大規模な組織の製造と維持において重要な問題であり、筋肉組織の血管ネットワークを促進するために多くの研究が行われてきました。例えば、複合 GeLMA (3.5～5%)-アルギン酸 (4%) バイオインクで内皮細胞と新生児心筋細胞を印刷して血管化された心臓組織を得るために、同軸ノズルを使用して中空構造を製造しました。さらに、肝臓、心臓、軟骨、皮膚、血管、脳、肺、腎臓、骨、脊髄、結腸、臍帯、膵臓、脂肪組織、骨格筋から抽出した dECM を含むバイオインクも、機能化複合バイオインクの構築に広く使用されています。

図4 過去15年間に発表された論文における3Dバイオプリント骨格筋に使用された材料の割合

骨格筋組織工学におけるバイオ 3D プリンティングの応用バイオ 3D プリンティングは、細胞の正確な位置決めと配置を実現します。例えば、マウスの筋芽細胞 (C2C12) は懸濁したハイドロゲルマトリックス内に正確に分散され、生理学的に反応する筋管を形成するように機能化されました。図 5a に示すように、バシル氏とその同僚は、柔軟な梁で接続された異なる長さの 2 本の剛性柱で構成される生物学的デバイスを 3D 印刷技術を使用して製造しました。溶液中のC2C12、細胞外マトリックスタンパク質、マトリックスゲルは、柱の周囲と柱の間に敷き詰められ、ゲル化によって剥がれ落ちる。ゲルの圧縮と2本の柱の間に生じる張力は、筋管の成熟を促す。電気パルスの刺激により、筋管は収縮し、シャクトリムシに似た這うような動きをする構造になる。図 5b に示すように、一対の拮抗骨格筋組織によって駆動されるバイオハイブリッドロボットは、拮抗筋として機能する骨格の両側に取り付けられた筋芽細胞搭載ハイドロゲルシートを能動的に刺激するための電極を搭載した 3D プリント樹脂骨格で構成されています。バイオハイブリッドロボットは、関節回転角度が90°に近い動作が可能で、簡単な動作を行うことができます。

図5 組織工学ロボット。 a. 組織工学で作製した哺乳類の骨格筋片で駆動できる、非対称の物理的設計を持つ 3D プリントされたハイドロゲルベースの「バイオロボット」。 b. 一対の拮抗する骨格筋組織によって駆動されるバイオエンジニアリングロボット。

骨格筋組織の機能的構築における積層造形の利点を図 6 に示します。電界紡糸技術では、整列または無秩序なポリカプロラクトンマイクロファイバー束を製造できます。マイクロファイバーをコラーゲンでコーティングすると、自然な筋肉をシミュレートでき、C2C12 は 2% コラーゲン - 2% ポリエチレンオキシド (PEO) でその表面にさらにバイオプリントできます。コラーゲンコーティングされた秩序だった繊維と秩序だった繊維の足場は、無秩序な繊維の足場に比べて、サルコメアの組織化と分化がより高度であることが観察されました。眼圧に関する別の研究では、C2C12 にゼラチン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、グリセロールからなるバイオインクを充填して印刷しました。印刷後、97% の細胞生存率が観察され、細胞は整然と配置され、分化培地で 7 日後には筋管が形成されました。構造体はヌードマウスの皮下に移植され、解剖された総腓骨神経が構造体に挿入されました。構造体内の神経統合が観察され、筋繊維と神経の接触部にアセチルコリン受容体クラスターが存在していました。さらに、構築物の血管新生は内皮細胞マーカーの発現によって誘導され、一方で筋電図検査では、設計された筋肉は電気刺激に反応し、未熟なままであることが示されました。さらに、マイクロ流体技術と生物学的 3D 印刷技術を組み合わせることで、骨格筋組織工学でより複雑な構造の製造が可能になります。例えば、マイクロ流体プリントヘッドを使用して 2 つの異なる光硬化性インクを正確に分割し、それぞれ C2C12 および BALB/3T3 線維芽細胞と混合して複雑な構造を印刷することで、2 種類の細胞を区画化して成長させることができます。連続培養により、整然と並んだ多核の完全横紋筋管を形成でき、この構造体をマウスの皮下に移植すると、分析により、密集して完全に成熟した完全横紋筋管が得られます。

図6 骨格筋組織工学における付加製造。 a. 骨格筋の階層構造を模倣したハイブリッドマイクロファイバーポリカプロラクトン/コラーゲンスキャフォールドの製造プロセスと光学/走査型電子顕微鏡画像。 b. 筋芽細胞の分化を促進するために 3D プリントされた脱細胞化足場。 c. バイオニック組織構造。筋肉前駆細胞は、PCL ピラーによって支えられたハイドロゲル繊維内に封入されました。 d. 筋芽細胞と線維芽細胞を含む異種ハイドロゲル繊維のマイクロ流体精密製造。

要約すると、生物学的 3D プリント技術は、組織工学、再生医療、医薬品開発において大きな可能性を秘めています。この技術は、移植臓器の不足を克服するのに役立ち、健康な組織モデルや病気の組織モデルを構築するための重要な工学的手法を提供します。

出典: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/smll.201805530

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