糖尿病性顎顔面骨再生のための生分解性金属足場の付加製造

出典: EngineeringForLife

外傷や病気によって引き起こされる顎顔面骨の欠損は、身体機能障害（咀嚼、発話、呼吸）だけでなく心理的損害にもつながる可能性があります。糖尿病（DM）に関連する顎顔面骨欠損の有病率は、人口の高齢化と都市生活に伴う不健康な食生活により増加し続けています。糖尿病に関連する顎顔面骨欠損の再生は、咬合負荷と高血糖微小環境のために依然として困難です。

この問題を解決するために、華中科技大学同済医学院口腔病学院のChen Lili氏、華中科技大学同済医学院付属連合病院口腔病学科のXu Zhi氏、Zhao Danlei氏は、付加製造によって分解性Zn-Mg-Cu勾配スキャフォールドを製造するための材料構造主導の戦略を提案しました。 Mg と Cu のその場での合金化により、Zn 合金は優れた圧縮強度を備え、機械的サポートと均一な劣化パターンを実現し、局所的な亀裂を防ぎます。この足場は、模擬高血糖微小環境において、優れた抗菌性、血管新生性、および骨形成調節性を示した。

関連する研究成果は、2024年6月29日に「材料構造主導型糖尿病性顎顔面骨再生のための分解性金属足場の付加製造」というタイトルでBioactive Materialsに掲載されました。
スキーム1 材料構造主導型糖尿病性顎顔面骨再生のためのZn-Mg-Cu勾配スキャフォールドの模式図
1. 亜鉛合金勾配らせんステントの特性評価 材料構造主導の骨再生を実現するために、著者らはレーザー付加製造 (AM) 技術を使用して、分解性亜鉛合金勾配らせん状足場を製造しました。まず、亜鉛合金スキャフォールドの印刷性、微細構造特性、および機械的挙動を調べました（図 1）。勾配らせん状スキャフォールドは、良好で緻密な表面遷移を持つ亜鉛合金粉末から製造され、双曲面の勾配トポロジー（多孔度 80%～60%）をもたらしました。微細構造分析の結果、Zn 合金には微細なセルと柱状の下部構造がランダムに分布しているのに対し、Zn のラス粒子は細長く粗いことが示されました。

合金元素とAM技術によって誘発される強化メカニズムを理解するために、Zn-Mg-Cu合金のTEM観察を実施しました。明視野画像では、細胞状粒子、転位の蓄積、および沈殿の存在が示され、粒界と転位の強化が示唆されました（図1F）。さらに、Zn-Mg-CuのHRTEM像は、4H型の長周期積層秩序（LPSO）構造を示しています（図1J）。高角度環状暗視野（HAADF）画像によれば、Mg および Cu 元素は Zn マトリックス全体に絡み合って均一に分布しており、固溶強化を示しています。さらに、マッピングにより、AM 技術によって Zn マトリックス内の元素の溶解が促進され、元素の偏析が緩和されることが実証されました。

図1 亜鉛合金勾配らせんステントの特性
2. 劣化と電気化学的挙動 著者らはさらに、亜鉛合金勾配らせんステントの劣化挙動を評価した。 28 日間の分解後、亜鉛合金ステントの表面に白い分解生成物が見られました。すべてのステントで明らかな部分的な破損は観察されず、亜鉛-マグネシウム-銅ステントの分解生成物は亜鉛-マグネシウムステントに比べてより均一に生成されました（図2A）。 SEM 観察により、Zn-Mg-Cu スキャフォールドの表面に小さな球状粒子が自然に形成されたことが示されました。分解した Zn-Mg-Cu スキャフォールドの EDS マッピングにより、スキャフォールド上に形成された白い化合物には Zn、Ca、O、P、Cl 元素が含まれていることが示されました (図 2B)。生体模倣リン酸カルシウム (CaP) 化合物は生体適合性と骨伝導性を備え、血管新生と骨形成を促進します。

さらに、著者らは、勾配螺旋構造の物質移動挙動を解析するために数値流体力学（CFD）モデルを構築した。透過性と圧力降下は、速度と圧力の等高線に示されているように、CFD シミュレーションによって計算されました (図 2C)。モデルは不規則な速度分布を示し、細孔中心で速度が最も高くなります。ほとんどの領域での流速は低く（<1.5 mm/s）、細胞接着と酸素輸送の強化に適した環境を提供しました。合金元素による劣化モードの違いを分析するために、電位動分極法（PDP）と電気化学インピーダンス分光法（EIS）の試験方法によって亜鉛合金の電気化学的腐食特性を評価しました。 Znと比較すると、Zn合金の腐食電位は負の方向にシフトしました（図2D）。ナイキスト線図 (図 2E) は、Zn-Mg 合金は低周波数で Zn よりもインピーダンスループが大きく、腐食傾向が強いことを示しています。

図2 亜鉛合金のin vitro抗菌性と生体適合性
3. 抗菌特性と生体適合性の特性評価 顎顔面領域では、解剖学的部位の開放性により骨インプラントはより複雑な微生物学的課題に直面することが多く、その結果、骨再生が失敗するリスクが高くなる可能性があります。そのため、Zn 合金インプラントは、微生物を効果的に管理し、欠損部分をうまく再建できるように、抗菌特性を強化して設計されています。グラム陽性黄色ブドウ球菌（S. aureus）およびグラム陰性大腸菌（E. coli）に対するZn合金の抗菌活性を評価しました。さまざまな Zn 合金を細菌と共培養し、SEM を使用してその形態を観察しました。結果は、S. aureus と E. coli の両方が Zn-Mg-Cu グループで培養された場合に顕著な収縮と損傷を示したことを示しました (図 3A)。さらに、平板展開法を用いて細菌付着試験を行ったところ、対照寒天培地ではS. aureusおよびE. coliのコロニーがほぼ完全に覆われていたのに対し、亜鉛合金ではコロニー数が著しく少なく、亜鉛-マグネシウム-銅合金ではわずかな数のコロニーしか観察されなかった（図3B）。亜鉛・マグネシウム・銅群の抗菌率は大幅に向上し、純粋亜鉛の4.5倍、亜鉛・マグネシウム群の2.6倍に達しました（図3C）。これらの結果は、亜鉛、マグネシウム、銅の組み合わせが細菌感染の制御に優れていることを確認しています。

骨芽細胞と内皮細胞は骨の再生プロセスにおいて重要な役割を果たし、インプラントの生体適合性を決定する上で不可欠です。この研究では、骨芽細胞前駆細胞株 MC3T3-E1 と内皮細胞株 HUVEC を使用して、亜鉛合金インプラントの in vitro 生体適合性を評価しました。 MC3T3 細胞と HUVEC 細胞を 25% 濃度のさまざまな亜鉛合金抽出物と共培養し、材料が細胞増殖に及ぼす影響を評価しました。亜鉛・マグネシウム・銅群は最も明らかな増殖促進能を示した（図3D）。さらに、生死染色を用いて、さまざまな亜鉛合金の MC3T3 細胞および HUVEC 細胞に対する細胞毒性を評価しました。 24時間の培養後、すべてのグループで死んだ細胞が赤く染まることはほとんどなく、亜鉛合金インプラントは明らかな細胞毒性作用がなく、良好な生体適合性を示したことが示されました（図3E）。

図3 抗菌性と生体適合性の調査
4. 模擬高血糖微小環境におけるin vitro血管新生能 骨再生のプロセスは血管新生のプロセスと密接に関連しています。糖尿病は全身性代謝疾患であるため、多くの血管機能障害を伴うことが多いです。高グルコースダルベッコ改変イーグル培地で培養された HUVEC 細胞を使用して、in vitro の高血糖微小環境における亜鉛合金の血管新生特性を評価しました。免疫蛍光染色により、高グルコース環境下では HUVEC 細胞の拡散が悪く、細胞の拡散領域が減少することが示されました。しかし、高グルコース誘発性細胞収縮はすべての亜鉛合金グループで部分的に緩和され、細胞生存率の改善が示された（図4A）。これに基づいて、細胞スクラッチアッセイを実施し、さまざまな亜鉛合金抽出物による HUVEC の in vitro 移動能力を評価しました。図 4B に示すように、亜鉛合金抽出物で 24 時間インキュベートした後、高グルコースグループと比較してスクラッチ幅が大幅に減少しました。 Zn-Mg-Cu群の治癒率は80％に達し、正常群とほぼ同等であり、HUVECの移動を促進する効果があることが強調されました（図4D）。

著者らはさらに、チューブ形成アッセイを使用して、亜鉛合金が血管新生を誘発する可能性を評価しました。図 4C に示すように、高グルコースは HUVEC 細胞における尿細管形成を阻害し、対照群と比較して脆弱で不完全な尿細管をもたらしました。 Zn-Mg-Cu抽出物を投与した後、明確な形態学的特徴を持つ毛細血管ネットワークがより多く観察されました（図4C）。定量分析の結果、対応するメッシュ、ノード、および合計の長さが他の治療グループよりも高いことが示され、Zn-Mg-Cuグループが血管新生を促進する調節能力を持っていることが示されました（図4E）。さらに、Zn-Mg-Cu グループは、HUVEC における VEGF タンパク質発現に対する高グルコース環境の阻害効果を大幅に軽減しました (図 4F-G)。結論として、Zn-Mg-Cu グループは、シミュレートされた高血糖微小環境における HUVEC の血管新生能力を強化し、長期的な骨再生に好ましい環境を作り出しました。

図4 高血糖微小環境をシミュレートした亜鉛合金のin vitro血管新生能
5. 模擬高血糖微小環境における骨芽細胞のin vitro骨形成分化 次に、著者らは高グルコース培地 DMEM を使用して、模擬高血糖微小環境における MC3T3-E1 細胞の骨形成分化に対する亜鉛合金の効果を研究しました。細胞の機能状態は ALP 染色によって評価され、高グルコース (HG) 群ではどの時点でも明らかな ALP 陽性染色は見られませんでした。 14日後、Zn-Mg-CuグループのALP活性はZn-Mg合金グループのそれを上回り、その差は統計的に有意でした。アリザリンレッド染色により、この結果はさらに裏付けられました（図5A）。亜鉛合金の骨形成効果を分子生物学的レベルでさらに評価するために、骨形成関連遺伝子のqRT-PCR検出を行った。亜鉛、マグネシウム、銅が相乗的に作用すると、個別に使用した場合と比較して骨形成分化能力が大幅に向上しました。さらに、免疫蛍光染色により、骨形成におけるグルコース代謝に関連する最も豊富な骨芽細胞特異的タンパク質であるオステオカルシンが、Zn-Mg-Cu抽出物で培養されたMC3T3細胞で増加していることが明らかになりました（図5D）。さらに、ウェスタンブロット分析を実施し、模擬高血糖微小環境における14日目のMC3T3細胞の骨形成分化能力を評価しました。Zn-Mg-Cuは、骨形成関連タンパク質（RUNX2およびOCN）のより高い産生を示しました。これらの結果は、細胞外マトリックスの石灰化とカルシウム沈着を促進するZn-Mg-Cuの顕著な効果は、模擬高血糖微小環境における骨芽細胞のグルコース代謝を調節することによって達成される可能性があることを示唆しています。
図5 模擬高血糖微小環境における亜鉛合金インプラントによるin vitro骨分化誘導
6. 糖尿病ウサギ下顎骨欠損部における亜鉛合金スキャフォールド誘導骨再生の生体内評価
最後に、著者らは、糖尿病状態下でのさまざまな亜鉛合金スキャフォールドの生物学的安全性と骨形成効果をテストするための移植実験を実施し、糖尿病ウサギ下顎欠損モデルを確立しました。糖尿病のウサギは手術後4週間と12週間で人道的に殺され、さらなる分析のために下顎骨が摘出されました。下顎欠損部における新しい骨形成の結果を観察するためにマイクロ CT スキャンを実施しました。下顎欠損部の3D再構成画像と冠状断像では、新しい骨が亜鉛合金スキャフォールドの多孔質構造に浸潤して成長しているのが示されたが、インプラントを移植していない糖尿病群では明らかな骨陥没が観察された（図6A）。定量的マイクロCT分析と再構成画像によると、移植後4週間で、Zn-MgおよびZn-Mg-Cuスキャフォールド周囲の新骨はZnインプラントのそれよりも著しく広範囲に広がっていました。 Zn-Mg-Cu インプラントの生体内分解挙動をマイクロ CT を使用して評価しました。植え込み後 4 週および 12 週で Zn 合金ステントの明らかな破損は発生しませんでした。したがって、Zn 合金スキャフォールドは機械的完全性を維持し、骨の治癒中の早期の機械的破損を防ぐことができました。

新しい骨の形成部位をさらに特定するために、カルセイン蛍光標識を実施しました。組織学的および蛍光顕微鏡画像では、インプラントの曲面に沿って石灰化が継続的に沈着および成長し、12週間の移植後にはZn-Mg-Cuスキャフォールドの周囲に構造化された新しい骨がよりよく観察されたのに対し、対照群では拡散した石灰化と炎症組織が出現したことが示されました（図6C-D）。カルセイン染色の結果と一致して、ヴァンギーソン染色では、明るい赤色に染色されたコラーゲン繊維が4週目と12週目に材料と組織の界面に形成され、Zn-Mg-Cuの勾配孔に成長したことが示されました（図6E）。全体的に、Mg および Cu 元素の組み込みと勾配構造の構築により、Zn-Mg-Cu スキャフォールドは、高血糖の微小環境において、より活発な治癒プロセスとより速い骨再生を提供する可能性があります。

図 6 糖尿病ウサギ下顎骨欠損における骨再生誘導における亜鉛合金スキャフォールドの効果の in vivo 評価要約すると、本論文では、分解性 Zn-Mg-Cu 勾配スキャフォールドを付加的に製造することにより、材料構造主導の糖尿病性顎顔面骨再生戦略を開発しました。境界工学戦略による Mg と Cu のその場での合金化により、スキャフォールドは優れた機械的強度と均一な劣化パターンを示しました。二重金属イオンの同時放出により、模擬高血糖微小環境における細菌の除去と骨芽細胞および内皮細胞の増殖が促進され、体外での良好な骨形成および血管新生能力が実証されました。さらに、生体模倣トポロジーと勾配構造の適切な透過性により、骨治癒中の骨伝導性が強化され、糖尿病ウサギ下顎欠損モデルにおける新骨の成長と形成が改善されました。全体として、この研究は、糖尿病性顎顔面骨欠損の治療における勾配 Zn-Mg-Cu スキャフォールドの臨床応用の可能性を示しています。

ソース：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.06.028

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