活性酵素触媒担体の高解像度3Dプリントにより、微細構造を通じて連続触媒反応器の合成効率を向上

出典: MF High Precision

生化学工学の分野では、酵素触媒反応は、その高い効率と合成環境に対する相対的な耐性でよく知られており、従来の化学合成ルートでは入手が困難な、経済的価値の高い化合物の合成と処理によく使用されています。しかし、酵素触媒反応に必要な活性酵素は、従来の合成プロセスでは高価で分離が難しい場合が多く、深刻な資源の浪費につながるだけでなく、酵素触媒プロセスのコスト管理も大きな課題となっています。そのため、学術界は活性酵素を触媒担体に担持する方法の探求に取り組んでいます。連続触媒反応器を構築することで、反応物が担体を連続的に通過して活性酵素と接触し、連続生産が可能になります。この方法は、酵素が反応溶液に直接入るのを防ぎ、その後の分離工程を省略し、酵素の利用効率と経済性を向上させます。しかし、この方式では、酵素がシステム内に直接配置されていないため、反応物との接触面積が限られており、酵素をシステム内に直接分散させる方法よりも合成効率が低くなるという問題もある。

3D プリント技術の台頭により、バイオベースの連続触媒反応器の製造に新たな機会がもたらされました。この技術により、触媒担体の三次元空間構造を正確に作成することができ、担体内の活性酵素と反応物との接触面積を最大化できるため、反応器の生産効率が向上します。近年の研究では、活性酵素触媒をポリマーハイドロゲルネットワーク内に固定することにより、触媒活性キャリア構造を製造することに成功しています。しかし、このタイプの構造が直面する大きな課題は、反応物がキャリア内の活性酵素に完全に接触することが難しいことです。基質の拡散特性により、表面上の酵素のみが効果的に触媒の役割を果たすことができ、その結果、内部の酵素が十分に利用されません。

この問題を解決するために、ノッティンガム大学の研究チームは、モルフォの精密表面投影マイクロステレオリソグラフィー（PμSL）3Dプリント技術と革新的なハイドロゲル配合を使用して、触媒酵素の活性を維持しながら、最大10μmの精度で微細な触媒キャリア構造を製造することに成功しました。この画期的な技術により、触媒担体と反応物との接触が大幅に強化され、システム全体の触媒効率が向上します。関連する結果は、「連続フロー合成に最適化された効率を備えた高解像度 3D プリント生体触媒反応器コア」というタイトルで、Chemical Engineering Science 誌に掲載されました。

この記事のバイオ触媒リアクターコアは、BMF nanoArch® S130（精度：2μm）3Dプリント装置を使用して直接印刷されました。本論文で使用した光硬化性配合物は、ポリエチレングリコールジアクリレート（PEGDA）、フェニルリン酸リチウム（LAP）、タートラジン、β-ガラクトシダーゼで構成されており、最小サイズ10μmの細孔構造と最小サイズ50μmの正方形の流路を高い忠実度で実現できます。 PμSL技術で処理された3次元酵素ベース触媒は、チャネルレス構造と比較して、最大60％の触媒効率の向上を実現しました。静的リアクターを動的連続リアクターに改造することで、動的触媒システム全体の触媒効率は静的触媒システムと比較して240％増加しました。

図 1. トポロジーを正確に制御した、生体触媒活性の 3D プリントリアクターコア。 a) 樹脂に使用される試薬の化学構造。 b) 平面投影マイクロステレオリソグラフィー（PµSL）。 c) メタクリル化シラン化シリコン基板は、印刷プロセス中に 3D プリントされたリアクターコアに共有結合され、印刷中に脱落するのを防ぎます。印刷後、シリコン基板はプラットフォームから簡単に分離できます。 d) マイクロメートルスケールのチャネル壁の厚さ w と辺の長さ p を持つ 3D プリントハイドロゲルの概略図。酵素は、印刷プロセス中にナノスケールのポリマーネットワーク（PEGDA 700 の長さは 4.7 nm）内にその場で捕捉されました。 e) シラン化基板を使用しない 3D プリントの例。印刷中にビルドプラットフォームから落ちて膜に付着し、忠実度が低下します。 f) 空気中に埋め込まれた酵素（β-ガラクトシダーゼ）を含む 3D プリントされたハイドロゲル（2 mm 立方体、p=150 µm、w=100 µm、7×7 の水平方向のチャネル）。シラン処理された基板への印刷。 g) プリントをプラットフォームから取り外し、水に浸します。 h) 優れた解像度を備えた高忠実度チャネル（達成可能な最小チャネルサイズは 10 µm）。
実験では、β-ガラクトシダーゼは未硬化ポリエチレングリコールジアクリレートに160分間さらされた後も80±10%の活性を保持することが示されました。同時に、緩衝液に浸した印刷部品の上清の活性を測定することにより、β-Galはハイドロゲルで包まれた後もほとんど漏れていないことがわかり、この方法の有効性がさらに証明されました。

研究チームは、無流動条件下でのβ-ガラクトシダーゼ含有構造の触媒活性の予備評価を実施した。一例として、一辺が 2 mm の立方体で、7×7 のチャネルが水平方向に配置されたリアクターコア (チャネル幅 150 μm、壁厚 100 μm) を例に挙げます。分光光度計による測定結果から、酵素を含むリアクターコアによって 420 nm で生成された生成物信号が、酵素を含まないサンプルの信号よりも大幅に強くなることが示され、リアクターコアを酵素触媒に使用できることが実証されました。

図 2. 静的分析による 3D プリント反応コア内の酵素活性の測定。 a) 3D プリントされた反応コアは、まずフローフリーバイアル内で分析されました。 b) 反応の模式図。基質 ONPG は、3D プリントされたリアクターコアに埋め込まれた β-ガラクトシダーゼの触媒作用によって加水分解され、ガラクトースと ONP が生成されます。その中で、ONPの吸光度は酵素活性を定量化するために使用されました。 c) 分光光度計によるテスト結果によると、酵素が埋め込まれた 3D プリント反応コアの生成物信号は、酵素が埋め込まれていない 3D プリント反応コアの生成物信号と比較して顕著です。代表的な反応コアコンポーネントのパラメータは、2 mm 立方体、p = 150 µm、w = 100 µm、水平方向に配置された 7 × 7 チャネルです。 3 つのサンプルをそれぞれテストしました (p < 0.001)。エラーバーは平均の標準誤差（sem）を表します。
次に、この記事では、さまざまな印刷構造が原子炉の性能に与える影響について検討します。チャネルのない立方体を参照サンプルとして採用した結果、触媒構造の辺の長さが増加するにつれて、比活性と合成速度の両方が低下することが示されました。これは、触媒コアのサイズが大きくなると、中心領域における酵素と反応物との間の拡散経路が長くなり、酵素利用効率が低下し、生成物の拡散が妨げられるためです。これは、従来のチャネルレスリアクターの生産規模を拡大する過程で酵素活性中心のアクセス可能性の問題が解決されない場合、容量を増やすと生産がすぐにボトルネックになることを示しています。

上記の現象に基づいて、反応物質の拡散と酵素のアクセス可能性の問題をさらに改善するために、研究チームは反応器の中心部にチャネルを設計しようとしました。チャネル幅は当初24μmに固定し、リアクターコアの壁厚を変更しました（24μm-480μm）。壁厚が480μmから24μmに減少すると、比活性が約40％増加し、壁厚が100μm未満の場合に特に改善が顕著であることが観察されました。このスケールは従来の 3D プリントでは実現が難しく、このタイプの構造における PμSL 技術の生産上の利点が改めて証明されています。実験では、壁の厚さを薄くしても合成速度が大幅に上昇しないことが観察されました。これは、壁の厚さを薄くすると拡散経路が短くなり合成速度が上昇しますが、酵素の総質量も減少するためです。この 2 つにはトレードオフがあります。さらに研究を進めると、壁の厚さを 24 μm に固定し、チャネル幅を変更すると (24 μm-96 μm)、比活性が 15% 増加することがわかりました。これは、チャネルが大きいほど熱対流が促進され、基質がハイドロゲルの中心に早く到達できるため、基質と酵素の接触機会が増えるためです。しかし、合成速度は 43% 低下しました。これは主に、チャネルサイズの増加によって印刷されたハイドロゲルの体積が減少し、その結果、酵素の質量が減少したためです。

実験結果に基づくと、比活性を最大化するために、薄いチャネル壁と大きな細孔を組み合わせると、比活性を 60% 増加させることができますが、これにより、流動条件下での大きな細孔の重要性が低下します。小さなリアクターコアの場合、細孔が小さくなり、酵素の質量が増加すると、合成速度が向上します。さらに、分析により、比活性と合成速度はマクロ的な表面積とほとんど相関していないことが示され、高解像度の 3D プリンティングにより、ハイドロゲル内の分子拡散の最大経路長を正確に制御できるため、生体触媒リアクターの性能を最適化できることがわかりました。

図 3. チャネルの寸法と壁の厚さを変えることで原子炉コアの効率を向上させる。 a) 3D プリントされた立方体のサイズを大きくすると、比活性 (b) と合成速度 (c) の両方が低下します。ハイドロゲルキューブのサイズは L = 1.25 ～ 2.0 mm で、埋め込まれた β-Gal が含まれていました。 d) チャネル間壁厚をw = 480から24μmに減らすと、リアクターコア効率が約50％向上します。比活性の変化の結果は（e）に示されており、合成速度（f）はこの範囲内でわずかに増加します。立方体のサイズはL = 2.0 mmに固定され、開口部は24 μmに固定されました。 g) チャネル幅をp = 24 μmから96 μmに増やすと、比活性(h)で示されるようにリアクターコア効率が向上しますが、合成速度(i)は低下します。エラーバーは平均の標準誤差（sem）を表し、3 回繰り返して実行されました。

次に、チームは完全な連続フローリアクターを設計し、印刷しました。組み立て後、研究者らはまず500μLの反応溶液を50μL/分の流速で反応器に注入し、このサイクルを9回繰り返した。実験の初期段階では、反応器が反応物と生成物の安定した流れ状態を確立するのに時間が必要だったため、出力比活性は低かった（0.16 μmol·min-1·mg-1）。しかし、サイクル数の増加に伴い、反応器は徐々に定常状態に達し、比活性も徐々に増加し、最終的に約0.8μmol·min-1·mg-1に達し、安定する傾向にあった。

比活性が安定した後、この論文では、流量が反応器の性能に与える影響をさらに調査しました。流量は25～1000μL/分の範囲で制御され、総反応容量は500μLに維持されました。実験結果によると、流量の増加とともに比活性が増加することがわかりました。最大流量が1000μL/分のとき、比活性は7.0μmol·min-1·mg-1に達し、静的実験で得られた最高比活性より200%以上高く、有効係数は64%に達しました。この結果は、以前の文献で使用された 3D 押し出し法 (<7%) および 3D ジェッティング法 (21.2%) と比較して大幅な改善です。合成速度も流量の増加とともに増加傾向を示しました。流量1mL/分では、合成速度は最大値0.29μg·min-1·mm-3に達し、静的実験と比較して240%増加しました。要約すると、変換率が低い場合、比活性/合成速度は流量に直線的に比例し、バルクフロー中の基質濃度は比較的安定しているため、流量は合成速度を制御する上で重要な要素になります。しかし、大量の試薬が反応せずにチャネルを流れてしまうという問題が依然として残っています。これは、現在のリアクターの基質利用効率にはまだ改善の余地があることを示しています。

図 4. 完全に 3D プリントされた連続バイオ触媒フローリアクター。 a) フローリアクター装置の概略図。シリンジポンプを使用すると、基質分子を制御可能な流量で 3D プリントされた生体触媒リアクターに注入できます。温度は設定点制御式ウォーターバスによって正確に制御されます。 b) リアクターコアに埋め込まれた酵素（β-ガラクトシダーゼ）を示すフローリアクターの拡大図。基質 ONPG がリアクターコアを通過すると、生成物であるガラクトースと ONP が得られます。 c) フローリアクターハウジングの CAD ファイル。矢印は流れの方向を示します。 d) 統合された原子炉コアと原子炉シェルの構造を示す CAD ファイル。 e) 3D プリントされたリアクターコア (PµSL) は、3D プリントされたリアクターシェル (AnyCubic) に統合されます。 f) β-ガラクトシダーゼの比活性は、繰り返しサイクル後に最初は増加傾向を示しましたが、その後 2 時間のサイクル期間で安定し始めました。 g) 1サイクルは、50 µL/分の速度で注入される500 µLの反応溶液で構成されます。 h) 流量が増加すると、比活性と合成速度も増加します。
概要: この研究では、高精度表面投影マイクロステレオリソグラフィー (PμSL) 3D 印刷技術を使用して、高解像度 (10 μm)、高忠実度の酵素活性ハイドロゲルリアクターコアを印刷しました。この構造は、チャネルフリーの 3D プリント部品と比較して、比活性を 60% 向上させ、100 μm 未満のスケールで効率のブレークスルーを達成し、高解像度の 3D プリントがリアクターの性能を最適化できることを証明しました。同時に、構築された 3D プリント連続バイオ触媒フローリアクターは優れた性能を備えています。最高流量では、静的実験と比較して合成率が 240% 増加し、有効係数は 64% に達しました。さらに、小型反応器の理論的な時間空間収率は良好で、商業的な高価値製品の生産の要件を満たしており、規模を拡大できれば、より持続可能な方向への医薬品製造を促進し、生体触媒の分野で新たなブレークスルーをもたらすことが期待されます。

オリジナルリンク: https://doi.org/10.1016/j.ces.2024.121156

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