機械的強度と生体活性を強化した3Dバイオプリント組織工学骨

出典: EngineeringForLife

大きな骨の欠損は身体の修復能力を超え、障害を引き起こし、患者の生活の質を著しく低下させることがよくあります。このような欠陥を治療するために、世界中で毎年約 220 万人の患者が骨移植を受けており、骨移植は輸血に次いで 2 番目に多い組織移植となっています。自家骨は、骨誘導性、伝導性、骨形成能に優れ、病気の伝染や組織拒絶反応の問題がないため、骨移植のゴールドスタンダードと考えられています。しかし、その治癒率は理想的ではなく、現在、大きな骨欠損の治癒遅延および癒合不全の発生率は 10% にも達します。これらの症状を持つ患者は通常の治癒患者の約2倍の費用がかかり、大きな経済的負担が生じます。さらに、自家骨の資源は限られており、採取プロセス中に痛み、血腫、感染などの合併症が発生することがよくあります。したがって、大きな骨欠損の治療には自家骨代替材料の開発が不可欠です。

ハルビン医科大学第二付属病院の王欣教授のチームは、免疫反応を一時的に調節し、炎症誘発性と抗炎症性のバランスを取り、骨の再生と修復を促進して、大きな骨欠損の治癒遅延と非癒合という課題に対処できる、新世代の組織工学骨構造を革新的に開発しました。マルチ物理場支援脱細胞化、側鎖生化学的修飾、滅菌凍結乾燥などの革新的な技術を使用して、新しい光硬化性細胞外マトリックスハイドロゲルである骨由来脱細胞化細胞外マトリックス (bdECM-MA) が合成されました。 bdECM-MA をシリコン置換リン酸カルシウムおよび骨髄間葉系幹細胞と組み合わせた後、デジタル光処理 3D バイオプリンティングによって組織工学骨が製造されました。この研究では、人工骨が MPa レベルの機械的強度を達成しながら高い細胞活性を維持することが in vitro で確認されました。さらに、この人工骨は優れた骨形成、血管新生、免疫調節機能を示しました。免疫調節機能の分子メカニズムの 1 つに、p38-MAPK 経路の阻害が関与しています。画期的な生体内発見は、天然の生体材料をベースにした組織工学による骨が、連続的な免疫調節特性を示し、炎症誘発性および抗炎症性の反応を連続的に活性化し、骨欠損の修復を大幅に加速するというものです。この研究は、自家骨代替材料の開発と大規模骨欠損の治療のための新たな研究基盤と効果的な方法を提供します。関連研究は、2024年8月18日に「機械的強度と生体活性を強化した3Dバイオプリント組織工学骨：連続的な免疫調節特性による骨欠損修復の加速」と題する論文として、Advanced Healthcare Materials誌に掲載されました。

【脱脂・脱塩の最適化と標準化】

この研究では、bdECM-MA の調製は、骨粉砕から始まり、脱脂、脱塩、脱細胞化、粉砕、消化、改質、そして最後に凍結乾燥という詳細な連続手順に従いました。最初のステップでは、液体窒素中で牛の骨を粉砕し、その後の処理に備えて 1 × 1 × 1 mm の未処理の正常骨 (NB) 粒子を生成しました。 NB 粒子のこの特定のサイズは、脱脂、脱塩、脱細胞化に使用される試薬と内在組織タンパク質との過度の接触による変性を防ぎ、より制御された反応を促進します。

脱脂工程では有機溶剤は使用せず、除去が容易で組織の生物学的活性への影響が少ないH2O2を選択しました。脱脂骨（DGB）を塩酸法で脱灰し、脱脂脱灰骨（DGMB）を製造した（図1a）。組織中の脂肪含有量を計算するために、ソックスレー抽出実験を実施しました。骨組織5gあたり脂肪含有量はわずか0.043±0.006gであり、12時間の脱脂後、脂肪除去率は95.74％±0.57％でした（図1b）。脱脂時間を延長しても、脂肪含有量と除去率は大幅に増加しませんでした。

図1c、dはDGBの脱灰プロセスを示しています。脱灰時間の延長に伴い、X線回折（XRD）では、0時間脱灰群の結晶HAピーク2θ26.21（002）、32.19（211）、40.06（310）が徐々に弱まり、6時間後には減衰が明確に確認されました。一方、フーリエ変換赤外（FT-IR）分光法では、脱灰されていない骨の1010.87、871.50、600.09、および556.51 cm−1のリン酸と炭酸のピークは、脱灰の6時間後に消失したことが示されました。さらに、1628.90、1536.28、および1234.74 cm−1のアミド結合を表すピークは、脱灰時間の増加とともに最初は鋭く、その後は鈍化する傾向を示し、最も鋭い時点は12時間でした。この現象は、骨ミネラルの除去によってより多くの内在タンパク質が露出し、それが 12 時間の臨界期間中に完全に露出することを示唆しています。 12時間後、組織が酸性環境に長時間置かれたことでタンパク質が変性し、ピーク値が緩やかになりました。

図1 改良されたbdECM調製プロセス[bdECMの最適消化時間]

bdECM の最適な消化時間を決定するために、染色とレオロジー試験を用いてそれぞれ構造的評価とレオロジー的評価を実施しました (図 2a)。改良マッソントリクローム染色（図 2b）では、1 日消化グループでは明らかに不完全に消化されたコラーゲン繊維の大きな断片が残っており、いくつかの赤く染色された構造があることが示されました。これらの構造は脱細胞化プロセスからの残留細胞質を表しており、弱い免疫反応を引き起こす可能性があります。しかし、2日間消化群では、不完全に消化されたコラーゲン繊維と赤く染色された構造が消失し、コラーゲン繊維の顕著な自己架橋が観察され、完全な膜が形成されました。 3日間消化群では、不完全に消化されたコラーゲン繊維や赤く染色された構造は観察されなかったものの、切片は主に断片化され分散したパターンを示し、自己架橋能力が低下していることを示しました。これらの所見はHE染色画像で明らかでした。

図2 bdECM-MAとSi-CaPの調製と物理的性質[異なる濃度でのバイオインクの生体適合性と細胞増殖活性]

細胞活性を維持する bdECM-MA および Si-CaP 濃度の予備スクリーニングの後、濃度に応じてマッチングおよびグループ分けすることで、最終的に 6 つのバイオインクが決定されました：5% bdECM-MA + 0.5 mg mL−1 Si-CaP (グループ A)、5% bdECM-MA + 1 mg mL−1 Si-CaP (グループ B)、10% bdECM-MA + 0.5 mg mL−1 Si-CaP (グループ C)、10% bdECM-MA + 1 mg mL−1 Si-CaP (グループ D)、20% bdECM-MA + 0.5 mg mL−1 Si-CaP (グループ E)、および 20% bdECM-MA + 1 mg mL−1 Si-CaP (グループ F)。これら 6 つのグループの生体適合性を評価するために、別の CCK-8 アッセイを実施しました。結果は、6 つのグループすべてが細胞生存率にプラスの効果をもたらし、OD 値が NC グループよりも有意に高かったことを示しました。本論文では、物質濃度が細胞増殖に及ぼす影響をさらに研究し、5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EdU）実験を通じて最適な濃度範囲を選択しました。図3aに示すように、増殖細胞を表す赤く染色された細胞の数は、グループAとBでは他の実験グループよりも有意に少なく、NCグループとの差は有意ではありませんでした。したがって、5% bdECM-MA は細胞増殖をほとんど促進せず、機械的強度も低いため、理想的な組織工学骨の製造には適していません。 bdECM-MA 濃度が一定である他の実験グループの中で、グループ C と E ではグループ D と F よりも赤く染色された細胞が少なかった。この研究チームによるこれまでの研究によれば、この現象は1 mg mL−1 Si-CaPの強力な骨形成誘導能によるもので、BMSCの骨芽細胞への分化を著しく促進し、それによってその増殖活性を低下させたとのことだ。

図3 3Dバイオプリントされた初期スキャフォールドの調製、特性評価および成分濃度測定[骨形成活性]

組織工学骨は骨髄間葉系幹細胞（BMSC）と共培養された（図4a）。骨形成分化の初期マーカーであるアルカリホスファターゼ（ALP）が染色画像によって定性的に検出されました。 ALP発現を示す青色染色の程度はNC群からE群、Si群、SE群にかけて徐々に増加し（図4b）、統計解析により群間で有意差が確認された（図4c）。この傾向はアリザリンレッドS（ARS）染色（図4d）でより顕著であり、SE群のARS発現はNC群の7倍高かった（図4e）。

図4 3Dバイオプリントされた新しい組織工学骨の骨形成活性の評価[血管新生活性]

この実験では、ラット大動脈内皮細胞 (RAOEC) を分離し、組織工学骨と共培養しました (図 5a)。 CD31免疫蛍光染色により、抽出された細胞は平らな多角形でCD31を強く発現していることが示され、一次RAOECであることが確認されました（図5b）。組織工学で作製した骨の血管新生活性を評価するために、管形成アッセイを実施しました。図5cに示すように、SEグループは他の3つのグループよりも強いチューブ形成能力を示し、EグループはSiグループよりも優れた性能を示し、SiグループはNCグループよりも優れた性能を示しました。しかし、観察研究とその後の統計分析の間には矛盾があります。 SE群とSi群の管数、総管面積、総管長はNC群よりも有意に高かったが、NC群とE群の間には有意な統計的差は認められなかった（図5d）。図 5c をさらに分析すると、グループ E の管壁が著しく厚くなり、細胞数が多くなったことが示され、bdECM-MA が RAOEC の増殖を促進したことが示されました。管壁が厚く、同じ視野内の細胞数が多いグループでは、管の数、管の総面積、管の総長さが減少すると予想されました。

図5 3Dバイオプリントされた新しい組織工学骨の血管新生活性の評価[免疫調節特性]

組織工学で作製した骨の免疫調節特性を評価するために、ラットの末梢血から単球を抽出し、マクロファージへの分化を誘導しました。抽出された細胞は円形または楕円形で、細胞体は不定形であり、細胞質は比較的均一であった。フローサイトメトリー分析により、細胞の 94.5% が M0 マクロファージ表面マーカー CD68 および CD11b を発現していることが示され、ラット M0 マクロファージが正常に抽出および誘導されたことが確認されました。その後、M0マクロファージはリポ多糖（LPS）を使用してM1マクロファージに誘導され、組織工学骨と共培養されました（図6a）。 WB および qPCR 分析により、NC グループでは、LPS 処理後、炎症誘発性メディエーター (iNOS、TNF-α) の相対的発現レベルが時間とともにわずかに増加し、細胞は主に M1 表現型を示すことが示されました (図 6b ～ d)。 3 つの実験グループすべてにおいて、初日には炎症誘発性メディエーターの発現の有意な減少は観察されなかったものの、時間の経過とともに徐々に減少が記録され、3 日目に最も顕著な効果が見られました。炎症誘発性メディエーターの発現レベルの減少は SE グループで最も顕著であったが、炎症誘発性反応の抑制は E グループと比較して Si グループでより顕著であった。抗炎症メディエーター（ARG-1、IL-10）の発現に関しては、重要な3日目に有意差が観察され、SE群が最も強い効果を示しました（図6b～f）。

図6 3Dバイオプリントされた新しい組織工学骨の免疫調節特性の評価[免疫調節特性の分子メカニズムの予備的調査]

免疫調節特性の特定のメカニズムを調査するために、3日間共培養した細胞の遺伝子配列決定を実施しました。火山プロット（図 7a-c、e）と複合ヒートマップ（図 7b-d、f）は、グループ間で遺伝子発現に有意な差があることを示しました。続いて、次数値によってランク付けされた上位 100 のターゲットをスクリーニングし、各グループの差次的に発現した遺伝子を潜在的なマクロファージターゲットと交差させ、タンパク質間相互作用ネットワークを構築することにより、その後のエンリッチメント分析を行いました。図 7g-i からわかるように、3 つのグループの遺伝子オントロジー (GO) エンリッチメント分析では、「炎症反応」と「免疫反応」が生物学的プロセス用語で大幅にエンリッチされていることが示されました。また、「細胞質、細胞外空間、分泌、細胞外マトリックス、細胞表面」が細胞成分用語でエンリッチされていること、および「成長因子とサイトカイン」が分子機能用語でエンリッチされていることが示されました。さらに、KEGG パスウェイ解析により、「TNF、IL-17、および Toll 様受容体シグナル伝達経路」がすべての実験グループで強化されていることが示されました。

図7 組織工学骨の免疫調節特性のメカニズムの予備的調査[生体内での組織工学骨の連続的な免疫調節特性の解明と分析]

組織工学で作られた骨の免疫調節特性をさらに研究するために、生体内実験が行われました。 NC（非移植群）、G群（3DバイオプリントGelMAスキャフォールド）、GB群（BMSCsを埋め込んだ3DバイオプリントGelMA組織工学骨）、EB群（BMSCsを埋め込んだ3DバイオプリントbdECM-MA組織工学骨）、GSiB群（BMSCsを埋め込んだ3DバイオプリントGelMA/Si-CaP組織工学骨）、およびESiB群（BMSCsを埋め込んだ3DバイオプリントbdECM-MA/Si-CaP組織工学骨）をそれぞれ構築した（図8a）。スキャフォールドと組織工学骨は、重大な頭蓋冠欠損を有するラットモデルに移植された（図8b）。

図8 組織工学骨におけるiNOSの動物モデルの構築とその免疫調節特性の組織学的分析

移植後1、2、3週間で、M1およびM2マクロファージマーカーiNOSおよびCD163の免疫蛍光染色を実施し、異なるグループにおけるM1およびM2マクロファージのリクルートメントレベルを評価した（図8cおよび9a）。一方、2週目と3週目には、EB、GSiB、ESiB群のiNOS蛍光強度はG群とGB群よりも有意に低く、EB、GSiB、ESiB群が持続的な炎症反応を抑制する効果があることが示された（図8d）。最初の週には、bdECM-MAを含むEBおよびESiB群でiNOS蛍光強度が強くなり、ESiB > EB > G > GSiB > GB > NCの傾向が見られました（図8d）。一方、EB、GSiB、ESiB群のCD163蛍光強度は他の群と比較して中程度に増加した（図9b）。さらに、2週目にはESiB > GSiBおよびEB > GB、G、NCというより明らかな傾向が観察され、3週目にはCD163の発現傾向はESiB、GSiBおよびEB > GB、G、NCにシフトしました（図9b）。時間の経過とともに、NC、G、GBグループのiNOSの蛍光強度は徐々に増加しましたが、EB、GSiB、ESiBグループのiNOSの蛍光強度は徐々に減少しました（図8e）。 NC、G、GB群ではCD163蛍光強度が低かったのに対し、EB群とESiB群ではCD163蛍光強度は第2週＞第3週＞第1週の順に減少した（図9c）。 GSiB群では、CD163蛍光強度は継続的に高い発現を維持し、第1週、第2週、第3週の間で有意差は見られなかった（図9c）。しかし、in vitro実験では、特にSE群では、初期段階では炎症誘発性メディエーターの発現に群間で有意差は認められず、その発現レベルはNC群よりも高くありませんでした。さらに、抗炎症メディエーターは、特にEBおよびESiBグループにおいて、初期段階で発現が増加する傾向を示さず、その後時間の経過とともに減少しました。

図9 組織工学骨におけるCD163の免疫調節特性の組織学的分析図10 生体内での組織工学骨の血管新生と骨形成

【概要と展望】
ここで、私たちは、連続的な免疫調節を通じて骨再生を大幅に刺激することができる、高い細胞活性と優れた機械的強度を備えた新しい組織工学骨を開発しました。組織工学による骨は、一連の革新的な技術を使用して Si-CaP と BMSCs を bdECM-MA に組み込むことによって合成され、DLP バイオプリンティングによって製造されました。材料間の静電反発力により、組織工学骨は高い細胞活性を維持しながら MPa レベルの機械的強度を実現します。さらに、人工骨は、bdECM-MA と Si-CaP の相乗効果により、優れた骨形成および血管新生活性と免疫調節能力の強化を示しました。骨形成および血管新生活性に寄与する分子メカニズムには、TLR4-PI3K-AKT 経路の活性化が関与し、それによって骨形成と血管新生の結合が促進されます。免疫調節機能の分子メカニズムの 1 つに、p38-MAPK 経路の阻害が関与しています。この研究の画期的な発見は、組織工学で作られた骨の免疫調節特性、すなわち炎症誘発反応と抗炎症反応の連続的な活性化です。私たちの知る限り、天然の生体材料をベースにした組織工学による骨でこの特性が実証されたのはこれが初めてです。優れた骨形成および血管新生活性と連続的な免疫調節特性のおかげで、この新しい組織工学骨は大きな骨欠損の治癒を大幅に加速しました。具体的な分子メカニズムについてはさらなる調査が必要ですが、この研究で得られた知見は、組織工学や骨の免疫調節の分野で進行中の議論に貴重な視点を提供します。

ソース：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202401919

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