同軸犠牲印刷による生体模倣血管ネットワークの機能組織への埋め込み

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

生体模倣血管ネットワークを備えた人間の組織や臓器を印刷することへの関心が高まっています。灌流可能なチャネルは無細胞および高密度細胞マトリックスに埋め込むことができますが、天然の血管に見られる生体模倣構造は現在利用できません。最近、米国ハーバード大学のジェニファー・A・ルイスとセバスチャン・GM・ユーゼルは、粒状ハイドロゲルと高密度細胞マトリックス内に階層的かつ分岐した多層血管ネットワークを生成できる埋め込み型バイオプリンティング法、機能組織の同軸犠牲書き込み（co-SWIFT）を開発しました。埋め込み型バイオプリンティング中に印刷された分岐血管間の強力なコア-コアおよびシェルの相互接続を容易にするために、同軸プリンティングヘッドに拡張コア-シェル構成が設計されました。最適化されたコアシェルインクの組み合わせを使用して、灌流可能な内腔を囲む平滑筋細胞で満たされたシェルで構成される生体模倣血管が、1) 透明アルギン酸微粒子、2) 犠牲微粒子を含むコラーゲン、または 3) ヒト人工多能性幹細胞由来の心臓球状体で構成される粒子マトリックスに同軸印刷されました。これらの相互接続された内腔内に合流した内皮細胞の層を移植することによって、優れたバリア機能を備えた生体模倣血管が作成されます。この研究では、共SWIFT心臓組織が灌流下で成熟し、同期して拍動し、体外で効果的な心臓薬物反応を示したことがわかった。この研究は、薬物試験、疾患モデル化、治療用途のためのスケーラブルなバイオ製造への新たな道を開きます。

関連の研究内容は、2024 年 8 月 2 日に「機能組織への同軸犠牲書き込みによる生体模倣血管ネットワークの埋め込み」というタイトルで Advanced Materials に掲載されました。

図1 機能組織における同軸犠牲書き込み（co-SWIFT）
この研究では、拡張されたコアシェルノズルと 2 つの独立して制御可能なコアおよびシェルインク流体パスで構成される新しい同軸プリントヘッドが初めて設計されました (図 1a)。コアノズルをシェルノズルより長く延長することは、分岐および再結合時に同軸ノズルがシェル層を貫通して親容器間のコア-コアおよびシェル-シェル結合を形成することを保証するために重要です (図 1b-e)。拡張されたコアは、糸状の特徴の殻壁を貫通して分岐点を作成するために使用できます (図 1d)。コアインクとシェルインクを押し出す際に、延長されたコアノズルを再度使用して、印刷されたフィラメントのシェルを突き刺しました (図 1e i)。同様の方法で、印刷された同軸フィラメントの自由端を接続することによっても接続を形成できます (図 1e ii)。同軸の相互接続が順次行われ、ますます複雑化する分岐血管ネットワークが構築されます。

図 2 co-SWIFT のコア、シェル、およびマトリックスの最適化この研究では、犠牲ゼラチンコアインクは、そのせん断減粘挙動と τy≈50 Pa が粒状アルギン酸マトリックスのそれと一致するように配合されました (図 2a)。それぞれのコアシェルインクの組み合わせは、このマトリックスの垂直方向に正常に印刷できました（図2b）。自然の血管系をシミュレートするために、この研究では、マレーの法則に準拠した 3 世代の分岐特性を持つ、異なる直径の同軸血管を印刷しました (図 2c)。図 2d は、各世代で同軸のコアシェル構造が維持された、印刷された血管の断面画像を示しています。総直径が 3 mm を超え 1 mm 未満の血管を作製するために、印刷速度を変えながら、コアインクとシェルインクを一定の体積流量で押し出しました (図 2e)。

図 3 印刷された生体模倣血管の内皮化埋め込まれた血管は、マレーの法則に準拠した 3 次元パターンを持つ階層的な分岐ネットワークで構成されています (図 3a-c)。印刷後、組織構造物を 37 °C に加熱して、シェルゲルインクと μPOROS マトリックス内のコラーゲンのゲル化と架橋を促進し、犠牲ゼラチンコア (赤) を溶かしました (図 3b)。血管新生マトリックスを PBS (青) で灌流し、相互接続された内腔ネットワークを明らかにしました (図 3c)。生理学的関連性をさらに向上させるために、本研究では、μPOROS マトリックス内の犠牲ゼラチンコアインクを取り囲む SMC を含むシェルインクで構成される生体模倣血管ネットワークを印刷しました (図 3d)。灌流7日目には、平滑筋細胞は生存したまま広がり、血管壁を取り囲んでおり、その形態は本来の内膜層と同様であった（図3e、f）。内皮細胞は接着結合部を有する合流性単層に配列していた（図3g-i）。次に、バリア機能を評価するためマイルズアッセイを実施したところ、裸の（対照）血管と比較して、合流した内皮を有する血管では染料の拡散が 3 倍減少することが示されました（図 3j）。

図4 co-SWIFTによる血管付き心臓組織の作製

この研究では、心臓臓器構成要素（OBB）を遠心分離法を用いて高密度細胞粘弾性マトリックスに詰め込みました（図4a）。まず、円筒形の心臓組織を作製し、その中にスプリングアームの間に吊り下げられたコアシェル容器を埋め込んだ（図4a～h）。 SWIFTと比較すると、co-SWIFT心臓組織の血管腔の丸みの値はほぼ2倍高かった（図4b、c）。灌流の 1 日後、co-SWIFT 心臓組織に対して生死アッセイを実施したところ、断面全体で細胞生存率が高いことが明らかになりました (図 4d)。灌流7日目には、埋め込まれた血管は平滑筋細胞に囲まれた合流した内皮細胞の層で構成されていました（図4e）。灌流5日目に、共SWIFT心臓組織は同期して収縮し始めました（図4f）。重要なのは、これらの組織が心臓においても効果的な薬物反応を示したことです。 10×10−6Mの濃度のイソプロテレノールを含む酸素化培地で灌流した後、自発的な拍動頻度が2倍になることが観察されました。対照的に、10×10−6Mブレビスタチンを含む培地の灌流はこれらの心臓組織の拍動を阻害した（図4g、h）。視覚化のために、初期の分岐と完全な動脈構造が透明なアルギン酸マトリックスと密に細胞が詰まった心臓OBBマトリックスに印刷されました（図4j-k）。

概要要約すると、この研究により、分岐した多層血管ネットワークを脱細胞化された高密度細胞組織マトリックスに埋め込むことができる初の同軸ベースのバイオプリンティング法が確立されました。幅広い適用性を実証するために、コア、シェル、マトリックス材料のレオロジー特性を、粒状アルギン酸塩、微多孔構造コラーゲン、心臓球状マトリックスへの印刷に合わせて調整しました。カスタマイズされた拡張コアシェルノズルを設計、製造、実装することで、犠牲コアインクを取り囲む充填平滑筋細胞シェルインクで構成される階層分岐血管を生成する能力を実証しました。このネットワークは、平滑筋細胞で包まれた相互接続された内腔を持ち、内皮細胞が播種されて、良好なバリア機能を提供する合流性内皮を形成します。最終的に、この研究では、患者固有のデータに基づいて設計され、生体模倣血管が埋め込まれた心臓組織が作成されました。この研究は、生体軟組織構造にバイオニック血管ネットワークを埋め込む可能性を示しています。

ソース：
https://doi.org/10.1002/adma.202401528

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