吊り下げられたサポートを外さない4S生物学的3D印刷方法

出典: EngineeringForLife

サスペンションバイオプリンティングは、特に人工血管ネットワークの製造において、微細な特徴を持つハイドロゲル構造を調製するために広く使用されています。懸濁バイオ 3D プリンティングでは、他のサポートメディアを必要とせずに、懸濁サポートバス内でバイオインクを直接印刷できます。現在最も広く使用されている懸濁液支持浴には、粒状ゲル材料、複合凝固材料、市販の増粘ゲルなどがあります。懸濁生物 3D プリンティングは、技術、材料、構造などにおいて多くの進歩を遂げてきましたが、その応用には依然として次のようなボトルネックがあります。

1. サポートバスでは通常、熱に敏感な材料や生体適合性のある材料が使用され、印刷後に除去する必要があるため、多細胞構造などの複雑な構造の製造には大きな制限があります。

2. 支持浴材料のサイズが大きく（> 20μm）、印刷後の表面精度が悪い。支持浴は通常、機械研磨またはマイクロ流体工学によって準備されますが、準備が複雑で、すぐに準備する必要があり、保管が難しく、コストが高くなります。

サスペンションサポートバスシステムにデンプンハイドロゲルを導入し、サスペンションサポートの除去を必要としない4S（シンプル、保管可能、安定、拡張可能）バイオ3Dプリント方法を提案しました。懸濁液支持浴は、デンプン粒子とゼラチンを加熱することで調製でき、プロセスが簡単（Simple）です。懸濁液支持浴は、冷蔵庫環境で4°Cに長期間保存でき、加熱後に懸濁液支持浴として使用でき、新しく調製してすぐに使用する必要がなく、保存性能が良好です（Storable）。懸濁液支持浴は、ミクロンサイズのデンプン粒子で構成されており、微粒子のサイズが安定しています（Stable）。懸濁液支持浴は拡張性に優れ（Scalable）、図1に示すように、さまざまな印刷材料や懸濁液材料と組み合わせて使用できます。

関連研究は、「除去不要で多細胞懸濁液浴ベースの 3D バイオプリンティング」というタイトルで Advanced Materials に掲載されました。浙江大学のHe Yong教授と浙江大学医学部第一付属病院のHu Yihe院長が論文の共同責任著者であり、共同筆頭著者は浙江大学医学部第一付属病院のLi Shuai、Li Jianping、Xu Jianの各研究員である。

図 1 吊り下げられたサポートを外さない 4S 生物学的 3D 印刷方法。 A: サスペンションサポートバスの準備プロセスは簡単です、B: サスペンションサポートバスは長期間保存できます、C: サスペンションサポートバス内のデンプン粒子のサイズは安定しています、D: サスペンションサポートバスは拡張可能です、E: サスペンションサポートバスはさまざまな印刷シナリオで使用でき、高精度でマルチセル製造機能を備えています。
研究内容 著者らはまず、懸濁液支持浴としてのデンプンハイドロゲルのメカニズムを調査した。アミロースとアミロペクチンからなるデンプン粒は加熱後に無秩序になり、アミロースとアミロペクチンが分離し、デンプンの糊化が起こります。このとき、デンプン粒は主にアミロペクチンで構成されています。冷却後、アミロースは再編成され、アミロペクチンを包み込み、不可逆なデンプンゲルを形成します。これはアニーリングプロセス（レトログラデーション）とも呼ばれます。デンプン粒を加熱した後、ゼラチンを導入します。アミロースとゼラチンの間の水素結合がアニーリングプロセスを妨げます。アミロペクチンで構成されるデンプン粒は、このシステムでは無秩序な状態で現れ、これにより、懸濁生物学的 3D 印刷プロセスがサポートされます。著者らは、印刷、遠心分離、XRD、FTIR を通じてこのメカニズムを検証しました。図2に示すように。

図2 懸濁液支持浴としてのデンプンハイドロゲルのメカニズム研究。 A: デンプン組成、B: 水中加熱後のデンプンの糊化プロセス、C: 冷却後の糊化デンプンのアニーリングプロセス、D: 糊化デンプンのアニーリングプロセスを妨げるゼラチンの導入、E: 懸濁生物 3D 印刷をサポートするデンプンハイドロゲル懸濁液支持浴の模式図、F: 異なる濃度のデンプンハイドロゲルの印刷可能性、G: 異なる濃度のデンプンハイドロゲルの遠心分離後のデンプン粒子の体積、H: アニーリング後のデンプンハイドロゲル懸濁液支持浴の反転実験、I: アニーリング後の異なる条件下でのデンプンハイドロゲル懸濁液支持浴の印刷結果、J: デンプンハイドロゲル懸濁液支持浴の XRD 試験結果、K: デンプンハイドロゲル懸濁液支持浴、デンプン、ゼラチンの FTIR 試験結果
さらに、著者らは、人工血管網の製造のためにデンプンハイドロゲル懸濁液支持浴にさまざまな構造を印刷し、懸濁液支持浴としてのデンプンハイドロゲルの実現可能性を検証しました。さらに、アルギン酸ナトリウム、キトサン、コンドロイチン硫酸、GelMA、SilMAなどの材料を懸濁液支持浴システムに追加し、懸濁液支持浴材料の選択範囲を拡大しました。レオロジー特性テストでは、懸濁液支持浴としてのデンプンハイドロゲルに必要な剪断減粘性と回復特性を検証しました。人工血管網の調製に関しては、著者らは、分岐構造、文字型構造、網膜血管網構造など、さまざまな構造の人工血管網を調製しました。網膜血管網犠牲テンプレートの印刷プロセスをビデオ1に示し、その浸透テストをビデオ2に示し、人工血管網を調製するための懸濁生物学的3D印刷の柔軟性を検証しました。図3に示すように。

図 3 デンプンハイドロゲルは懸濁液支持浴の範囲を拡大し、人工血管ネットワークを準備します。 A: デンプンハイドロゲル懸濁液支持浴で異なる間隔で犠牲テンプレートを印刷、B: デンプンハイドロゲル懸濁液支持浴で異なる層で犠牲テンプレートを印刷、C: 懸濁液支持浴としてデンプンハイドロゲルに異なるハイドロゲルを導入、D&E: デンプンハイドロゲル懸濁液支持浴のレオロジー試験、F: 異なる構造の人工血管網の準備、G: 網膜血管網構造、H: 網膜血管網印刷経路計画、I: 網膜血管網犠牲テンプレート印刷結果、J: 網膜血管網浸透試験結果
懸濁バイオプリンティングでは、押し出されたインクが懸濁支持浴媒体と直接接触します。したがって、懸濁液支持浴中の粒子サイズは、人工血管ネットワークの表面精度に直接影響します。血流抵抗を減らすために、人体の血管網の内面は比較的滑らかになっています。そこで、人工血管ネットワークの表面製造精度を向上させるために、著者らは、異なるサイズ（多様性）のデンプン粒子が人工血管ネットワークの表面粗さに及ぼす影響を調査しました。結果は、4.8±1.4μmの大きさの米澱粉で作られた人工血管ネットワークの表面粗さの値が最も低く（2.5±0.2μm）、これは生体大動脈の内面粗さ（≈2μm）に非常に近いことを示しました。この研究ではさらに、バルーン止血シミュレーション実験を通じて、高精度に設計された血管ネットワークを準備することの重要性を検証しました。図4に示すように。

図4 デンプンハイドロゲル懸濁液支持浴は血管ネットワークの表面精度を向上させます。 A: 加熱前後の異なるサイズの澱粉粒子のサイズと印刷性、B: 異なるサイズの澱粉ハイドロゲル懸濁液支持浴で調製した血管ネットワークの表面精度テスト、C: 異なるサイズの澱粉ハイドロゲル懸濁液支持浴で調製した血管ネットワークの表面SEM画像、D: 異なる表面粗さの血管ネットワークの止血効果、E: 止血バルーンとテストサンプル、F: 異なるサイズの澱粉ハイドロゲル懸濁液支持浴で調製した血管ネットワークの止血シミュレーション実験、G: 異なるサイズの澱粉ハイドロゲル懸濁液支持浴で調製した血管ネットワークの血液遮断シミュレーション結果
本研究では、3次元固体構造の印刷と製造のために、アルギン酸ナトリウムを印刷インクとして使用し、デンプンハイドロゲル懸濁液支持浴でさまざまな構造の印刷を実現しました。印刷された構造は、37°Cで懸濁液支持浴を除去することによって得られました。また、GelMA、SilMA、DexMA、AlgMAなどの材料を印刷インクとしてデンプンと組み合わせることができます。このシステムで印刷および光硬化した後、懸濁液支持浴を除去して印刷された構造を取得し、印刷インクの範囲を拡大しました。著者らはさらに、分岐血管モデル、人間の手モデル、大腿骨モデルを印刷し、デンプンハイドロゲルも除去可能/犠牲材料として使用してさまざまな構造の製造を実現できることを包括的に検証しました。図5に示すように。

図 5 3 次元固体構造を作製するための除去可能な材料としてのデンプンハイドロゲル懸濁液支持浴。 A：デンプンヒドロゲル懸濁液中の低粘度アルギン酸ナトリウムの印刷結果B：カルシウムイオンを含む澱粉ヒドロゲル懸濁液サポートバスにおける低粘度アルギン酸ナトリウムの結果、C：印刷された繊維の長さの定量分析、D：異なる繊維構造の印刷と製造：e著者は、生体適合性の観点から、最初に内皮細胞ネットワークを注入しました異なる密度の細胞の負荷を認識し、培養期間中、培養期間中、細胞の生存率は90％を超えました。図6に示すように。

図6 デンプンハイドロゲル懸濁液支持浴の生体適合性試験。 A：内皮細胞は、さまざまな構造を持つ血管ネットワークで内皮細胞膜を形成します。B：澱粉ヒドロゲル懸濁液サポートバスにおけるMC3T3-E1細胞の生産染色、C：デンプンヒドロゲルサスペンションサポートバス、D：Starch Hydrogel Suppention Suppern Suppentのサポートレート（澱粉ヒドロゲル懸濁液中のMC3T3-E1細胞のS（ARS）染色、F：澱粉ヒドロゲルサポートバスにおけるMC3T3-E1細胞のALP染色の定量分析：G3T3-E1細胞の定量分析であるMC3T3-E1細胞の澱粉ハイドロゲルサスペンションサポートバス、MC3-ED細胞の比較澱粉中の3T3-E1細胞は、異なる密度のあるサポートバスをサポートします
多細胞勾配構造を製造するために、著者らは多細胞皮膚モデルをターゲットとし、この印刷システムの下に血管内皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトを搭載し、図7に示すように血管網を含む多細胞勾配構造の印刷と製造に成功しました。これにより、サスペンションサポートを取り外すことなく、本論文で提案した4S生物学的3D印刷方法の有効性が包括的に検証されました。

図 7 サスペンションサポートを外さない 4S バイオ 3D 印刷方法を使用して、血管ネットワークを含む多細胞皮膚モデルを製造します。 A: 血管網を有する多細胞皮膚モデルの印刷と製造の概略図、B: 作製した皮膚モデルにおける多細胞細胞の分布、C&D: 血管網を有する多細胞皮膚モデルの免疫蛍光染色

出典: https://doi.org/10.1002/adma.202406891

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