機能的な血管構造として人工ナノ結晶ドメインを備えた 3D プリントハイドロゲル

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

3D プリント (3DP) ハイドロゲルベースの血管構造は、3D 構造形状を正確に複製してその機能を近似することにより、損傷した血管または臓器の機能への対応として研究されてきました。しかし、それらは依然として本質的な脆弱性という課題に直面しており、縫合による穿刺に耐えられず、血液と直接接触すると長期的な構造的および機能的安定性を維持することができません。

華南理工大学の Xuetao Shi 氏らは、ポリビニルアルコール (PVA) ベースのインクを使用してハイドロゲルベースの血管構造物をデジタル光処理 (DLP) 3D プリントし、その後、人工ナノ結晶ドメインとそれに続く表面改質によって機械的強度を強化したことを報告しました。調製された高精度ハイドロゲル血管構造は、非常に望ましい機械的強度、縫合許容性、抗腫脹特性、抗血栓特性、および長期開存性を備えています。特に、精密な弁構造を備えたハイドロゲルベースの生体模倣静脈グラフトは、一方向の流れを制御する上で優れた性能を発揮し、ビーグル犬の深部静脈に移植後 4 週間以内に生物学的機能と開存性を達成し、慢性静脈不全の治療における有望な可能性を確認しました。関連研究は、2024年9月4日にACS Nano誌に「機能的な血管構造物として設計されたナノ結晶ドメインを備えた3Dプリントハイドロゲル」というタイトルの記事として掲載されました。

1. 革新的な研究内容<br /> ポリビニルアルコール (PVA) は規則的な構造と柔軟な分子鎖を持っているため、結晶化によって PVA ハイドロゲルの機械的特性を調整することができます。さらに、ヒドロキシル基の機能化が容易であることと、優れた生体適合性および血液適合性を兼ね備えているため、望ましい特性を持つ血管構造物を製造するのに理想的な材料となっています。ここでは、ポリビニルメタクリレート官能化ポリビニリデンフルオライド（PVAGMA）からなる高分子前駆体インクのDLP 3Dプリントによってハイドロゲルベースの血管構造物を製造する方法について報告します。その後、アルカリ溶液で処理してナノ結晶ドメインを設計し、洗練された3次元構造、優れた靭性、機械的強度、抗膨張性、縫合耐性を備えた3DPハイドロゲル構造物を生成します（図1a）。本論文では、調製手順に応じて、これらをアルカリ処理光硬化性 PVA (AP-PVA) ハイドロゲルと名付けています。ハイドロゲル表面を、Arg-Gly-Asp (RGD) ペプチドを含むゼラチンなどの生体活性パターンで機能化することにより、AP-PVA ハイドロゲルベースの構造は、大幅に改善された内皮化ポテンシャルと、その結果として生体内での血液適合性を備えました。こうした一連の優れた特性は、これまで 3DP ハイドロゲル材料の同じシステムで同時に報告されたことはありませんでした (図 1b、c)。さらに、本論文の方法は、多分岐グラフトや小型血管ネットワークなど、構造的に複雑なさまざまな移植可能な血管構造を構築することができます。通常、作製された生体模倣弁静脈グラフト（BVVG）は、天然の静脈弁に匹敵する構造と機能を備えた弁を有しており、機能障害のある深部静脈の置換にも使用できます（図1d）。当社のハイドロゲル血管構造物作成方法は、さまざまな臨床ニーズに合わせて調整でき、血管機能の回復に効果的なソリューションの継続的な開発に貢献する可能性があります。

図1 ナノクリスタル工学による3Dプリントハイドロゲルは複雑な血管構造の構築に使用されます
ナノクリスタルドメインエンジニアリングによる機械的強度の高い 3D プリント PVA ベースのハイドロゲル<br /> 図 1a は、ナノクリスタルドメインエンジニアリングによる 3DP ハイドロゲル (AP-PVA ハイドロゲル) の調製プロセスを示しています。 DLP 3D プリント用に PVA 鎖を光架橋可能にするために、まずポリマー鎖をグリシジルメタクリレートとの化学反応によって機能化しました。 PVAGMA は、さまざまな分子量 (Mw) と置換度 (DOS) で容易に入手できます。同じ Mw (75 kDa) の PVA の場合、DOS が低い (例: 0.35%) と、機械的に弱い P-PVA ハイドロゲルが生成され、3D プリント中に構造をサポートできなくなる可能性があります。過剰な化学架橋（例：DOS 0.8%）は鎖の可動性と規則性を制限する可能性があり、これもその後の結晶ドメインエンジニアリングには適していません。一方、分子量が増加すると、架橋率が低くてもゲル化とそれに続く結晶化が促進されますが、粘度の増加など、印刷に不利な要因が伴う場合があります (図 2a)。最後に、DLP 3D 印刷用の PVAGMA インク水溶液は、Mw 75 kDa、DOS 0.5%、濃度 9 wt% で最適化されました。5 mg/mL のリチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスファイト (LAP) を光開始剤として使用し、1.0 mg/mL のタートラジンを光吸収剤として使用しました (図 2a)。 3DP ハイドロゲル構造は高い構造忠実度で容易に製造でき、その後のナノ結晶ドメインエンジニアリングにより機械的特性を効果的に調整できます (図 2b)。

結晶化を誘発する適切な戦略を探求するために、凍結融解法、乾式アニーリング、塩析法、アルカリ処理（15重量％NaOH溶液への浸漬）などのさまざまな方法が採用され、3DPハイドロゲル構造の強度が向上しました。対応するハイドロゲルの3次元寸法変化と機械的特性を評価した（図2b、c）。乾式焼鈍処理したサンプルはわずかに高い強度を示しましたが、不均一な脱水プロセスにより、寸法収縮が一定せず、構造が大きく変形しました。対照的に、凍結融解および塩析処理に対して安定した十分に高い結晶性を誘導することは困難であり、そのため 3DP ハイドロゲル構造の強度を大幅に高めることはできません。特に、アルカリ処理により、一貫した体積収縮を確保しながら機械的特性が大幅に改善されました (図 2c)。

図2 機械的強度の高いAP-PVAハイドロゲル構造の3Dプリント
ハイドロゲルベースの機能的血管構造の 3D プリント<br /> この論文で最適化された製造プロセスと機械的強化戦略に基づいて、複雑な 3D 形状の血管構造を製造できます。この論文では、まず AP-PVA ハイドロゲルを使用して心臓内に多分岐大動脈弓構造を構築し、三尖弁を備えた大動脈弁構造を開発し、逆流防止の有効性を予備的に実証しました (図 3a)。さらに、人体の小血管は構造が複雑で、それに応じた移植片を準備するのが困難です。本論文では、内径 0.75 mm の血管構造を作製することに成功しました。この血管構造は密閉されたままであり、灌流中に液体の漏れは観察されませんでした (図 3b)。これらの成果は、血管移植片の形状とサイズをカスタマイズする当社のアプローチの利点を浮き彫りにしています。肺血管系などのより複雑な血管系では、血管や気道の複雑なマルチスケールのトポロジー構造が採用されており、同様の機能を実現するためにその構造を模倣し再構築することは依然として困難です。外部構成を調整することで、最小表面構造の内部チャネルを独立した絡み合った 2 相空間に分割します。これら 2 つの空間間の巨大な表面接触により、ガスと血液の相互作用が促進され、機能的な人工肺構造の構築に不可欠なものとなります。隣接する 2 つのチャネルに酸素と水を注入すると、出力水中の溶存酸素が 6.55 mg/L から 6.75 mg/L に増加し、注入速度を遅くすると水中の溶存酸素レベルがさらに増加することが観察されました (図 3c)。さらに、セルサイズを調整することで、設計された構造は接触面積を増やすことができ、1立方センチメートルの構造内で最大15平方センチメートル（9×9セルの場合）に達します。これにより、私たちの構造は、埋め込み型人工肺を開発する上で大きな可能性を秘めています。

図3 3Dプリントされたハイドロゲルベースの機能性血管構造とそのin vitro機能
ハイドロゲルの表面改質と生体適合性<br /> 小さな血管グラフトは、長期の移植中に血栓症を起こしやすく、特に弁があり血流が遅い（約 10 cm/秒）静脈グラフトの場合は、血管グラフト不全につながります。（54）内皮細胞（EC）層は天然の血管の内層に存在し、血栓症を防ぎ、一時的な血栓を分解する機能物質を放出します。いくつかの細胞を含む血管構造が開発されているものの、倫理的問題、免疫原性の懸念、培養期間の長さ、そして多くの場合機械的特性の不十分さなどにより、臨床応用は依然として限られています。これらの課題を考慮すると、移植後にその場で内皮化が可能な無細胞血管構造の開発は有望な代替手段となります。細胞毒性試験により、AP-PVA ハイドロゲルは優れた in vitro 細胞適合性を持つことが示されました。 PVA ハイドロゲルは本質的に優れた低血栓性を備えていますが、親水性が高く、細胞接着部位がないため、EC の接着と拡散はできません。 Arg-Gly-Asp (RGD) ペプチドを含むゼラチンなど、細胞接着を促進する生理活性成分による表面機能化は、細胞接着を促進する効果的な戦略であることが示されています。アルカリ処理プロセスの結果、これらの生理活性成分の構造が破壊され、細胞接着がわずかに改善されました（図4b）。この課題に対処するために、塩基処理後の表面改質、すなわちN,N′-カルボジイミダゾール（CDI）を介した化学アンカーリング（図4a）を採用しました。 FTIR スペクトルにおけるアミド部分の信号ピークの出現、接触角の表面親水性の変化、およびフルオレセインイソチオシアネート (FITC) ゼラチンに対応する緑色蛍光の出現により、ハイドロゲル構造へのゼラチンのグラフトが成功したことが確認されました。この改変されたハイドロゲル構造は AP-PVA-G と呼ばれます。 ECの接着性が大幅に改善され、AP-PVA-G人工血管チューブの内壁に沿ってより均一に広がるようになりました（図4b、h）。さらに、免疫蛍光アッセイでは、ハイドロゲル表面に接着したヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) とヒト血管平滑筋細胞 (HVSMC) が正常な表現型を保持していることも示されました (図 4f、g)。

図4 3DPハイドロゲルベースの構造物の表面機能化により生体適合性が向上する
ビーグル犬の深部静脈置換のための生物学的血管移植当社の 3DP ハイドロゲル構造が病変血管を置き換える人工血管としての可能性を検証するために、ビーグル犬の後肢の深部静脈置換術を端から端までの縫合によって実施しました。ビーグル犬の脚の主な静脈血管は、大腿静脈、伏在静脈、筋肉内に位置する深部静脈など人間のものと似ており、一方、固有の弁はランダムに分布しています。弁の機能を評価するために、術中X線血管造影により順行性および逆行性静脈造影を実施した（図5a、b）。順行性イメージングの結果、3DP ハイドロゲル静脈移植後、造影剤がハイドロゲル静脈を正常に通過し、血管が開通したままであることが示されました。逆行性の結果、移植前に弁が存在しなかったため、造影剤が深部静脈に浸透する可能性があることが示されましたが、この症例では弁がまったく存在しないため、病気が存在することを意味するものではありません。しかし、ハイドロゲル血管を移植した後は、造影剤の浸透が制限され、弁の機能性が実証されました（図 5c）。さらに、超音波画像診断法を使用して 3DP ハイドロゲル血管の開存性をモニタリングしたところ、1 か月の移植期間中、開存性が維持されました (図 5e)。移植から1か月後、ビーグル犬の血液検査結果は正常のままでした。免疫蛍光染色の結果、BVVG の内側に付着した細胞が、平滑筋細胞 (SMC) 特異的マーカーである α-平滑筋アクチン (α-SMA) と、内皮細胞 (EC) 特異的マーカーであるフォン・ウィルブランド因子 (VWF) を発現していることが示されました。これにより、移植後 1 か月で血管細胞の接着と増殖が実証され、BVVG 上に内皮層を形成する可能性があることが示されました (図 5 d)。これらの結果は、当社の 3DP 人工弁付き静脈が長期的な深部静脈置換に有効であることを予備的に確認するものです。
図5 ビーグル犬の深部静脈への3DPハイドロゲルベースのBVVG（生体血管静脈グラフト）の移植
【概要と展望】
ここでは、PVA（ポリビニルアルコール）ベースの前駆体インクを3Dプリントすることで機械的に強力なハイドロゲルベースの血管構造物を製造する戦略を提案します。ナノクリスタルドメインを導入することで靭性と強度を大幅に向上させ、高い忠実度、構造の複雑さ、機械的強度、血液適合性などの血管構造物の要件を満たすことができます。試験管内および生体内での研究では、機能的な血管置換におけるその有望な応用と、特に 3DP 生体模倣弁を含む静脈グラフトを使用したビーグル犬の深部静脈置換のケースで、内部の流れを細かく制御できる好ましい弁構造が実証されています。したがって、本論文の 3DP ハイドロゲル構造は、臨床的な個別化血管移植および血管化臓器構築の研究において大きな可能性を秘めています。より一般的には、この設計および製造プラットフォームは、移植用のさまざまな人工組織や臓器の作成を拡大する可能性を提供します。

ソース：

https://doi.org/10.1021/acsnano.4c08359

機能的な血管構造として人工ナノ結晶ドメインを備えた 3D プリントハイドロゲル

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