無細胞マトリックスバイオインクに基づく3Dプリント真皮の新しい研究結果

出典: Shangpu Biotechnology

背景

火傷は皮膚外傷の4番目に多い原因です。ショックや敗血症に加えて、皮膚外傷部位で拡大したり縮小したりし続ける傷跡も、火傷の最も深刻な合併症の1つです。患者の外見を損なうだけでなく、患者の心身の健康にも深刻な影響を及ぼします。瘢痕の収縮を防ぐ最も先進的な方法としては、早期の移植または皮弁移植があります。しかし、このような治療法は、ドナーまたは皮弁部位に瘢痕拘縮を引き起こす可能性があり、皮膚/皮弁の供給源が不十分であるなどの要因によって制限されることがよくあります。したがって、臨床での実施には困難が伴います。いくつかの研究では、3D プリントとバイオインクを使用して皮膚の傷の修復のための皮膚類似体を準備し、良好な実験結果を達成したと報告されていますが、現在の研究のほとんどは、肉眼的な傷の治癒プロセスではなく、in vitro 材料媒介細胞反応に焦点を当てています。さらに、瘢痕拘縮の抑制におけるこのような生体材料の役割を裏付ける証拠と結論は現在不十分です。したがって、新しい真皮材料と複合生物学的 3D プリント技術の開発を探求することは、患者の皮膚傷の修復の質を向上させるための新たな希望をもたらすでしょう。

最近、中山大学第一付属病院火傷外科のQi Shaohai教授の研究チームと中山大学材料科学工学学院のChen Yongming教授のチームにより、皮膚表面の創傷修復に関する「3Dプリント真皮特異的細胞外マトリックスは、早期血管新生とマクロファージM2分極を誘導することで瘢痕収縮を緩和する」というタイトルの記事が、Zone 1バイオメディカルおよびZone 1バイオマテリアルジャーナルであるBioactive Materialsに共同で掲載されました。

研究チームは、長年の臨床応用経験を持つ豚真皮細胞外マトリックス材料を出発点として、豚真皮細胞外マトリックスの主成分を効率的に保持できる生物活性粉末を調製し、この粉末を使用して生物学的3Dプリント用の温度感受性インクを調製しました。研究チームはこのインクと押し出し 3D 印刷を使用して、数百ミクロンの空間構成を持つ皮膚真皮構造アナログ (PDA) を準備しました。実験結果によると、3Dプリントで作製した真皮類似体は生体適合性に優れ、皮膚移植後の早期血管新生を効果的に促進できる。さらに重要なのは、皮膚再生関連遺伝子の発現を調節することで、皮膚移植創の拘縮による瘢痕化を効果的に抑制できることである。

実験結果

1. 豚真皮細胞外マトリックス超微粒子粉末（dECM）の調製と特性評価

まず、DAPI、マッソン染色、トルイジンブルー染色などの実験方法を用いて、機械的断片化によって組織特異的な超微細細胞外マトリックス粉末やグリコサミノグリカン（GAG）などの局所細胞挙動に影響を与える機能性分子が得られることを証明しました。

2. 3Dプリント技術を用いたin vitro皮膚類似体（PDA）の作製

印刷温度（18〜20℃）、インク濃度（8.5wt％）、印刷速度（50mm/分）などの印刷パラメータはレオロジー試験によって最適化および決定され、in vitro皮膚類似体（PDA）は3D印刷によって準備されました。 3D プリントで構築された皮膚のような構造はグルタルアルデヒドで架橋され、その後、in vitro 分解および細胞毒性実験にかけられました。実験結果によると、化学的に架橋された PDA は、56 日間の in vitro 分解後も良好な構造的完全性を維持していました。 PDA の表面に L929 線維芽細胞を接種し、細胞の生死染色と MTT アッセイを使用して、この PDA が優れた生体適合性を持つことを証明しました。

3. 生体内実験 - 皮膚創傷移植片の収縮の評価

ラットの全層創傷モデルを用いて、分層皮膚移植（STSG）における創傷治癒と収縮に対するPDAの効果を評価する。

実験結果では、PDA は、陽性対照 (PL) として市販されている皮膚用製品 Pelnac よりも、瘢痕の収縮を軽減し、創傷治癒を促進する点で優れていることが示されました。

4. 皮膚移植後の術後変化と遺伝子解析

異なる時点で採取した皮膚摘出切片の組織染色により、PDA は創傷線維化を効果的に軽減し、コラーゲン沈着の成熟を促進すると同時に、損傷した毛包、皮脂腺、その他の付属器官をある程度修復することが判明しました。同時に、代謝およびシグナル伝達経路遺伝子の追跡を通じて、PLグループとPDAグループの動物間の外傷表現型の違いは、物質を介した遺伝子レベルでの外傷細胞の一連の変化によって引き起こされたことが発見され、判明しました。

5. 皮膚移植における血管新生の解析

研究では、皮膚移植の初期段階では、機能的な新しい血管の生成が移植された皮膚類似体の正常なメカニズムの維持と関連しており、新しい血管の形成は瘢痕形成とそれに伴う皮膚収縮を防ぐことができることがわかった。この実験では、移植後の移植片の生存は、移植片周囲の微小血管密度と関連する遺伝子データの顕微鏡観察によって判定されました。手術後、PDA群の微小血管数は、最初は増加し、その後減速する傾向を示しました。同時に、新生血管形成を誘導し、肝線維化を促進するGrem1遺伝子の検出により、PL群の新生血管形成に関与する関連シグナル経路の遺伝子が上方制御傾向を示し、組織学的結果と一致していることが示されました。

6. 手術部位におけるマクロファージの分極

皮膚損傷は一連の炎症反応を引き起こします。この反応に関与するすべての免疫細胞の中で、m 表現型 (M1 から M2) への変換は、創傷修復調節の重要な条件であるだけでなく、物質と新しい組織の統合と瘢痕形成の重要な要因でもあります。各セグメントのマクロファージの表現型は、CD68、CRR7、およびCD163の免疫組織化学によって評価されました。実験結果によると、14日目以降、PDA移植創傷におけるM2の割合はISおよびPL移植創傷よりも有意に高くなっており、創傷が再上皮化を促進し、肉芽組織の発達を特徴とする修復段階から安定段階への移行を促進していることが示されています。

結論は

本稿では、豚真皮無細胞マトリックスを使用して3Dプリントし、PDA移植片を組み立てる新しい瘢痕防止法を報告します。PDA移植は、創傷収縮と瘢痕形成を大幅に軽減できます。同時に、PDA移植群は、効率的な早期血管再建、マクロファージのM2表現型への分極化の強化、皮膚機能のより良い維持による修復効果を示しました。修復結果は、正常な皮膚形態に似ています。この研究は、分子生物学を通じて皮膚の創傷修復と瘢痕形成における移植片の遺伝子調節機構をさらに解明し、同時に、将来的に生体材料による皮膚の抗瘢痕特性の改善とその臨床応用可能性に一定の基礎を築いた。

参考文献

Chen L、Li Z、Zheng Y、Zhou F、Zhao J、Zhai Q、et al. 3Dプリントされた真皮特異的細胞外マトリックスは、早期血管新生とマクロファージM2分極を誘導することにより瘢痕収縮を軽減します。Bioactive Materials 2022;10:236-46。

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.09.008

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