清華大学熊卓の AM 研究グループ: SPIRIT の段階的なサスペンションプリント技術により、3D プリントされた複雑な臓器がより具体的で「魂のこもった」ものになります。

出典：清華大学熊卓研究グループ

組織や臓器の体外での機能的再構築はバイオ製造分野における長年の目標ですが、組織や臓器の複雑な外部構造と内部の微細構造（血管など）の結合構築は依然として極めて困難です。この問題を解決するために、清華大学の熊卓と張庭の研究グループ（BRE チーム）は、可逆インクテンプレート（SPIRIT）での連続印刷を提案しました。関連する結果は最近、材料分野のトップジャーナルである Advanced Materials（IF = 32.086）に「自由形状血管ネットワークによる複雑な臓器のエンジニアリングのための埋め込み型 3D バイオプリンティング機能の拡張」というタイトルで掲載されました。 SPIRIT 技術は、以前の研究で開発された、せん断減粘性と自己修復性の両方の特性を持つマイクロゲル二相性 (MB) バイオインクを活用し、MB バイオインクを印刷可能なインクおよび懸濁媒体としてマルチレベル印刷ステージで使用することで、灌流可能な血管ネットワークを含む心室モデルの構築に成功しました。これは、既存の生物学的 3D 印刷技術では不可能でした。 SPIRIT技術は、従来の押し出し3Dプリントの技術的限界を効果的に拡大し、複雑なマクロ構造や微細血管を持つ組織や臓器の迅速な構築を可能にし、医療分野における人工組織や臓器の変換と応用を加速することが期待されています。

この記事の第一著者は清華大学機械工学部バイオ製造センターの助手研究員Fang Yongcong氏であり、責任著者は清華大学機械工学部バイオ製造センター副所長のXiong Zhuo准教授です。この研究には、清華大学機械工学部バイオ製造センター所長の孫偉教授、准研究員の張庭氏、修士課程の郭怡漢氏、博士課程の呉炳燕氏が共同で参加した。この研究は、中国国家自然科学基金共同基金重点基金プロジェクト（U21A20394）、清華大学人材導入スタートアップ基金（53330200321）、国家重点研究開発プログラムプロジェクト（2018YFA0703004）、中国ポストドクター科学基金プレステーション基金（2021TQ0184）の支援を受けて行われました。

背景組織/臓器の体外機能再構築はバイオ製造分野における困難な課題の1つであり、生物学的3Dプリンティング技術は、バイオマテリアルを層ごとに正確に積み重ねることができるため、大きな関心を集めています。ハイドロゲルの機械的特性の悪さを考慮して、懸濁バイオ 3D 印刷技術がますます注目を集めています。簡単に言えば、この懸濁液媒体は、独自のせん断減粘性と自己修復性を備えています。降伏応力下では流体であり、応力のない状態では固体です。バイオインクの自由な形成をサポートでき、懸濁液媒体は洗浄または加熱によって除去できます。たとえば、カーネギーメロン大学の研究者は、ゼラチン微粒子媒体に浮かぶ実物大の人間の心臓モデルを印刷できる FRESH テクノロジーを開発しました。外部構造の複雑さに加えて、機能的な組織/臓器を構築する上でのもう一つの障害は、階層的な血管ネットワークの欠如であり、これにより酸素と栄養素の供給が制限されます。犠牲テンプレート技術とマルチマテリアル印刷技術は、組織構造における複雑な血管ネットワークの構築に広く使用されています。近年では、生体模倣度の高い血管ネットワークの印刷に、懸垂型生物学的 3D 印刷も使用されています。具体的には、細胞を運ぶ懸濁媒体に犠牲インクを懸濁させて印刷し、印刷後に犠牲インクを溶解して中空チャネルを得る。たとえば、ハーバード大学の研究者が提案した SWIFT テクノロジーでは、ゼラチン犠牲インク懸濁液をオルガノイド懸濁液媒体に印刷し、その後ゼラチンを除去して灌流可能な血管ネットワークを取得します。まとめると、FRESH 技術は複雑な形状を構築できるものの、血管網などの内部構造を形成することが難しく、SWIFT 技術は生理学的レベルに近い細胞密度の血管組織を構築できるものの、組織の形状は容器によって大きく制限され、天然の組織や臓器の外部構造を再現することが難しいということになります。

したがって、複雑な組織や臓器の外部の幾何学的特徴と内部構造の結合形成を実現するための新しい 3D 印刷プロセスの開発が急務となっています。この目標を達成するために、BRE チームは段階的な懸濁生物 3D 印刷技術 (SPIRIT 技術と呼ばれる) を提案しました。これには、少なくとも i) 懸濁液媒体にバイオインクを印刷して組織や臓器の複雑な外部構造を取得する、iii) 最初に印刷されたが架橋されていない構造に犠牲インクを印刷して自由形式の血管ネットワークを取得する、iii) その場で架橋し、懸濁液媒体と犠牲インクを除去する、などが含まれます。 SPIRIT 技術の鍵となるのは、印刷インクと懸濁媒体の両方として機能できるバイオマテリアルの使用です。研究チームは、以前の研究で開発された細胞を含んだマイクロゲル二相バイオインクを使用しました。このインクは、広い温度範囲にわたって優れたせん断減粘性、自己修復性、および迅速なその場光架橋機能を示し、SPIRIT 印刷技術に適しています。

図1 段階的な懸濁液生物学的3D印刷戦略
1. MBバイオインクの特性評価と印刷
MB バイオインクはマイクロゲルとハイドロゲルの前駆体で構成され、変動係数が 2.5% 未満 (図 2b) のマイクロ流体工学によって製造されます (図 2a)。流路設計と流量調節により、マイクロゲルの幾何学的形状とサイズを制御することができます (図 2c)。 MBバイオインクは優れた印刷性能を示し、さまざまな構造に印刷することができました（図2d-e）。 hiPSC を搭載したゼラチン/アルギン酸マイクロゲルは、カルシウムイオンと微生物トランスグルタミナーゼ (mTG) によって二重に架橋されており、架橋後の細胞活性は中程度でした (図 2f)。マイクロゲルを同じハイドロゲル前駆体と混合してMBバイオインクを得ました（図2g）。印刷および架橋後、hiPSC の生存率はわずかに低下しました (図 2h)。これは、印刷プロセスが細胞の生存率に一定の影響を与えたことを示しています。培養中、hiPSCは増殖を続け、胚様体（EB）の形で成長する傾向がありました（図2i）。胚様体の直径は培養時間とともに増加し（図2j）、増殖速度が速いことを示しています（図2k）。 8日目の免疫蛍光染色（図2l）とフローサイトメトリー分析（図2m）により、hiPSCが良好な多能性（> 80%）を維持できることが確認されました。心筋細胞分化培地を添加した後、hiPSC は心筋細胞への分化を開始しました (図 2n)。 14日間の分化後、拍動する心臓オルガノイドが観察され（図2o）、hiPSCを搭載したMBバイオインクがin situ増殖および分化を通じて特定の組織器官を形成できることが実証されました。
図2 細胞を含んだMBバイオインクの特性評価と3Dバイオプリンティング
2. 複雑な構造を構築するためのバイオインクのサスペンションプリンティング ジグザグ構造を例にとり（図3a）、サスペンション印刷プロセスのパラメータを最適化しました。印刷された構造と設計されたモデルの違いを定量的に比較するために、構造類似性指数（SSIM）を使用して、温度が印刷精度に与える影響を評価しました。まず、印刷された構造の画像をバイナリ画像に変換し、しきい値セグメンテーションを実行して平均フィラメント幅と SSIM を決定しました (図 3b)。結果は、印刷温度を上げるとフィラメントが広くなり、24 °C で SSIM が最も高くなることを示しました (図 3c-d)。一定の印刷速度で押し出し速度を制御することにより、印刷されたマイクロフィラメントの直径をリアルタイムで調整できます (図 3e)。完全な心臓モデル (図 3f-g)、開いた心室 (図 3h-i)、および気管支モデル (図 3j-k) が Carbopol 懸濁液媒体で印刷されました。管状構造の形状忠実度を定量的に評価することにより、直接印刷とサスペンション印刷の印刷精度をさらに比較しました（図3l-m）。光架橋後、カルボポール懸濁液媒体を除去し、懸濁印刷構造の外径と高さはモデル設定値よりわずかに高くなり、直接印刷サンプルのサイズはモデル設定値よりわずかに低くなった（図3n）。これは、サスペンション媒体が存在すると、フィラメント層間の接続が比較的緩くなるためと考えられます。

吊り下げられた印刷構造は、繰り返しの高ひずみ伸張に耐えることができ（図 3o-p）、優れた機械的特性を備えていることがわかります。さらに、鋳造および吊り下げられたプリントされた固体シリンダーに対してそれぞれ軸圧縮試験を実施し、応力-ひずみ曲線を取得し、弾性率を計算しました（図3q）。懸垂印刷構造の弾性率は鋳造構造の約2倍であり（図3r）、MBバイオインクの懸垂印刷が軟組織構造の製造に適用できることを示しています。さらに、HepG2 細胞を例として、懸濁液印刷プロセスが細胞活動に与える影響をテストしました。細胞生存率は Live/Dead 染色によって評価され、HepG2 を搭載した純粋な GelMA バイオインクがコントロールとして使用されました (図 3s-t)。細胞を含んだマイクロゲルは 3D ファイバー内に均一に分散しており、細胞活性は対照群よりもわずかに低かった (図 3u)。考えられる理由としては、MB バイオインクの調製プロセス、Carbopol 懸濁液媒体、印刷中のせん断応力などが挙げられますが、懸濁印刷構造内の HepG2 細胞は、最初の 5 日間で対照群よりも速い成長率を示しました (図 3v)。

図3 複雑な構造を構築するためのMBバイオインクのサスペンション印刷
3. MBインクを懸濁液として使用し、あらゆる形状の血管を印刷する MBバイオインクの懸濁媒体としての能力を検証するために、透明容器に移し替え、犠牲ゼラチンインクの懸濁印刷に成功しました（図4a）。印刷されたフィラメントは、押し出し速度によって直径が異なります。押し出し速度を変えることで、フィラメントの幅を 250 μm から 1000 μm まで制御できます (図 4b-c)。 MB バイオインクのレオロジー特性は温度による影響が少ないですが、印刷の忠実度は依然として温度変化によってある程度影響を受けます (図 4d)。 MBバイオインクを懸濁液マトリックスとして印刷するために、MBバイオインクを特定の形状の透明な型に充填し、バイオニック分岐チャネルを設計して印刷しました（図4e）。印刷後、光架橋を行い（図4f-g）、温度を37℃に上げてゼラチンを除去し、中空チャネルを得ました。灌流可能性を実証するために、チャネルに青色インクを灌流しました (図 4h)。 HepG2を充填したMBバイオインクは、灌流可能なチャネルが印刷された懸濁液媒体としてさらに調製され、HepG2を充填したMBバイオインクの初期細胞活性は90％であった（図4i）。 18 時間の灌流培養後の観察では、チャネル灌流によって組織全体の細胞活動が大幅に増加することが実証されました (図 4j)。

さらに、HUVECを充填したゼラチンインクを使用した構造体では内皮化チャネルを形成でき、3日目にはHUVECがチャネル内に均一に分布していることが観察されました（図4k）。 7日目には、細胞が増殖してチャネル内に均一な内皮層を形成し（図4l）、周囲のマトリックスに移動しました（図4m）。さらに、赤色MBバイオインクを透明MBバイオインクに懸濁させることで、押し出し忠実度の高いグリッド構造を印刷することができた（図4n-o）。印刷されたインクの分布を視覚化するために、赤と緑の GelMA マイクロゲルをそれぞれインクと懸濁液媒体として使用しました (図 4p)。これらの結果は、MB バイオインクが印刷インクとしても懸濁液媒体としても使用できることを直接示しています。

図4 印刷用懸濁液媒体としてのMBバイオインク
4.SPIRIT印刷工程 前述のように、BRE チームは新しいステップバイステップのサスペンションプリンティング (SPIRIT) 技術を開発しました。印刷プロセスは次のとおりです。(i) 一次印刷: MB バイオインクを Carbopol またはゼラチン微粒子サスペンションメディアに印刷して、複雑な外部構造を構築します。(ii) 二次印刷: 一次印刷が完了したら、犠牲インクをまだ架橋されていない一次印刷構造に印刷し、MB バイオインクの可逆的な自己修復特性を使用して、任意の形状の血管ネットワークを構築します。(iii) 架橋: インサイチュー光架橋または温度架橋により、印刷された組織構造が硬化および架橋され、手順 (i-ii) で印刷構造の構造的完全性を維持します。(iv) サスペンションメディアと犠牲インクの除去: 温度変化または希釈によってサスペンションメディアを除去して印刷構造を取得し、犠牲インクを同時にまたは個別に除去できます (図 5a)。既存の 3D プリント技術と比較して、SPIRIT 技術は、複雑な外部および内部の微細構造を持つ組織や臓器を構築できます。

インク濃度が印刷性能に与える影響を調査するために、5wt%および7.5wt%のGelMA MBを含むバイオインクを調製し、Carbopol懸濁媒体と赤色ゼラチンを使用してSPIRIT印刷をテストしました。一次印刷段階では、5% および 7.5% MB バイオインクの両方が、Carbopol 懸濁液媒体内の中空の管状構造に正常に印刷されました。ただし、二次印刷段階では、7.5% MB バイオインクでは針が移動して回転しましたが (図 5c)、5% MB バイオインクではこれが明らかではありませんでした (図 5d)。考えられる理由は、7.5％MBバイオインクのせん断降伏ひずみが懸濁液媒体よりもはるかに高いのに対し、5％MBバイオインクのせん断降伏ひずみは懸濁液媒体よりも大幅に低いことです（図5e-f）。そこで、らせん状のフィラメントを含む管状構造を5% MBバイオインク（図5g-h）を使用して印刷し、懸濁培地と犠牲インクを除去した後、青色の培養培地で灌流することに成功しました（図5i）。スパイラルチャネルのサイズは設計値に近いため、SPIRIT プリントの構造忠実度が優れていることがわかります (図 5j)。繰り返し実験での構造寸法は非常に類似しており、SPIRIT テクノロジの再現性が高いことが証明されています (図 5k)。

図5 MBバイオインクに基づくSPIRITプロセス研究
5. SPIRIT は階層的な血管ネットワークを持つ心室構造をプリントします 心臓は、非常に密な血管網を持つ中空の心室器官です。しかし、既存の生物学的3D印刷技術では、複数の心室と血管網を持つ組織構造をまだ構築できません。そのため、本研究では、血管付き心室モデルの印刷を使用して、SPIRIT技術の印刷能力を実証しました。まず、簡略化された心室モデルを作成し、心室モデルの中央面に位置する階層的な血管ネットワークを設計した（図6a-b）。 MB バイオインクを使用して心室構造を印刷した後 (図 6c)、赤色ゼラチンインクを使用して二次印刷を続け、血管ネットワークを作成しました (図 6d-f)。二次印刷段階では、スキャン回数を制御したり、一定のスキャン速度で押し出し速度を変えたりすることで各枝の直径を調整し、最終的に階層的な血管網を持つ心室構造の印刷に成功しました（図6g-h）。懸濁培地と犠牲インクを除去した後、心室内の階層的血管ネットワークを繰り返し灌流することができた（図6i-j）。 SPIRIT の印刷機能を完全にテストするために、この研究ではより複雑な形状の血管ネットワークを設計しました。まず、2次元平面で樹木のような血管網を設計し、さらに曲げて冠動脈に似た血管網を形成しました（図6k）。酸素移動の数値シミュレーション結果によると、密な血管ネットワークにより心筋室の酸素供給効率が大幅に向上することが示されました（図6l）。 SPIRIT プロセスを使用して、直径が異なる高密度の血管ネットワークを正常に印刷できました (図 6m-n)。印刷された構造のマイクロ CT スキャンにより、設計されたモデルと印刷された構造間の偏差のクラウドマップが生成され (図 6o)、SPIRIT 印刷の形状忠実度の高さが実証されました。印刷された心室の形状は、印刷ノズルによって何百回も剪断された後でもそのまま維持されることに注意することが重要です。

印刷された心室の機能性をさらに評価するために、新生児ラット心筋細胞 (NRVC) を使用して MB バイオインクを準備し、簡略化された心室構造を印刷しました (図 6p)。印刷された心室はいくつかのスライスに切断され (図 6q)、共焦点イメージングを使用して構造情報と細胞情報を取得しました。生死染色により、印刷された血管ネットワークが体外培養中に印刷された組織の活動を大幅に促進したことが示されました (図 6r-s)。 10日目に、印刷された心筋組織は同期収縮を起こし（図6f）、免疫蛍光染色により筋原線維の形成と細胞の相互接続が確認され、印刷された心室の初期成熟が示されました（図6u）。これらの結果は、SPIRIT で印刷された心筋組織が正常な機能を持つことを確認するものであり、臓器印刷などの医療用途における SPIRIT 技術の応用の見通しを示しています。

図6 灌流可能な血管ネットワークを備えたSPIRITプリントチャンバー構造
要約と展望 本研究では、複雑な外部構造と微細な内部特徴の結合印刷構築を実現できる新しい段階的懸垂型バイオ3D印刷（SPIRIT）技術を開発し、良好な灌流性と収縮性を備えた複雑な血管ネットワークを持つ心室構造を初めて印刷しました。さらに、SPIRIT テクノロジーは印刷時間を短縮でき、既存のサスペンションメディアや犠牲インクシステムとの互換性が高く、せん断減粘性と自己修復特性を持つ他のハイドロゲルインク (超分子ハイドロゲルなど) に拡張できるため、複雑な組織や臓器の in vitro 機能再構築のための新しいソリューションを提供します。

参考文献: Fang Yongcong、Guo Yihan、Wu Bingyan、他「自由形状血管ネットワークによる複雑な臓器の設計に向けた埋め込み型 3D バイオプリンティング機能の拡張」Advanced Materials、2023、2205082。

出典: 10.1002/adma.202205082

BRE チームについて:
バイオプリンティングおよび再生工学 (BRE): 清華大学バイオ製造センターのバイオプリンティングおよび再生工学チームは、バイオ製造、バイオ 3D プリンティング、再生医療、組織工学などの最先端分野に焦点を当て、進歩を共有し、経験を交換しています。

清華大学熊卓の AM 研究グループ: SPIRIT の段階的なサスペンションプリント技術により、3D プリントされた複雑な臓器がより具体的で「魂のこもった」ものになります。

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