香港城市大学の胡金蓮院士（AFM）：生物学的3Dプリントと生体模倣細胞足場のための組み換えクモタンパク質ハイドロゲル

出典: EngineeringForLife

組み換えクモタンパク質は、新しい生体材料を作成するための多くの可能性を提供します。しかし、その多形性と凝集しやすい性質により、製造と実際の応用には課題が生じます。香港城市大学の胡金聯院士とそのチームは、変異した組み換えクモタンパク質が37℃で可視光照射下で迅速かつ制御可能にハイドロゲルを形成できることを報告した。変異クモタンパク質では、（GGX）繰り返し配列内のフェニルアラニン残基（F）がチロシン残基（Y）に置き換えられ、βシートの自己組織化とアミロイドナノフィブリルのさらなる形成が促進されます。ミセル/球状クモタンパク質溶液は、ナノフィブリルネットワークで構成されたクモタンパク質ハイドロゲルに変換され、その後、ビスチロシンによってさらに架橋されました。構造変化のプロセスは、分光法、透過型電子顕微鏡 (TEM)、分子動力学シミュレーションによって検証されました。さらに、クモタンパク質ハイドロゲルは、優れた生体適合性、せん断減粘性、ナノフィブリルネットワーク構造に基づいて、バイオインクや生体模倣細胞足場として使用されています。この研究の結果は、クモタンパク質の構造変換メカニズムを明らかにし、生物医学工学における応用を拡大するものです。

関連の研究内容は、2024年12月26日に「バイオ3Dプリンティングおよび生体模倣細胞足場のための調整可能な機械的特性を備えたナノフィブリルで構成された組換えミニチュアスピドロインハイドロゲルの急速形成」というタイトルでAdvanced Functional Materialsに掲載されました。

図1 人工組換えマイクロスパイダータンパク質とそのハイドロゲル形成メカニズムの模式図

図2 タンパク質発現と分子動力学計算

図3 ハイドロゲルの調製と構造変化の特性評価

クモタンパク質と比較して、M-クモタンパク質はゲル形成中にミセル/球体からβシートおよびアミロイドナノフィブリルに容易に変換され、ジチロシンによってさらに架橋することができます（図1c-e）。タンパク質構造の完全性を維持するために、本研究ではMaSp2のフェニルアラニン（F）をチロシン（Y）に置き換える保存的変異を実施しました。設計されたクモタンパク質と変異クモタンパク質のコアドメイン配列を図1aに示します。 Mini-MaSp2 は 329 個のアミノ酸から構成され、NT と CT の両側に MaSp2 ドメインの繰り返し領域があります (図 1b)。

設計されたタンパク質は大腸菌（E. coli）によって生産され、固定化金属親和性クロマトグラフィー（IMAC）とサイズ排除クロマトグラフィーカラムによってさらに精製され、SDS-PAGEによって特徴付けられました（図2a）。クモタンパク質および変異クモタンパク質調製物のタンパク質収量は、それぞれ116 ± 14および121 ± 24 mg L−1でした。変異により、ファンデルワールス力と静電相互作用が強くなり、タンパク質が自己組織化する傾向があります (図 2e)。クモタンパク質/M-クモタンパク質水溶液は37℃で急速にハイドロゲルを形成し、さらに青色光によって架橋されます（図3a、b）。ゲル化プロセス中のクモタンパク質の構造変化を調べるために、まず円二色性 (CD) が採用されました。図2bに示すように、M-スパイダーミン/スパイダーミンのCDスペクトルは208および223 nmで強いピークを示しており、すべての温度でのタンパク質の立体配座は主にαヘリックスおよびランダムヘリックス構造であることを示しています。温度が 10°C から 70°C に上昇すると、両方のタンパク質がらせん構造を展開し始め、β シート含有量は 4.15% から 17.61% に増加しました (図 2c)。 4 °C および 37 °C の水溶液中のクモタンパク質と M-クモタンパク質のスナップショットを図 2 d、e に示します。さらに、異なる温度におけるクモタンパク質とM-クモタンパク質の2つのREP領域間の方向平均相互作用自由エネルギーを計算しました（図2f、g）。 M-スパイダーミン/スパイダーミンの構造変換プロセスを理解するために、FTIRおよびXRD分光法を用いて二次構造を定量的に評価した（図3c～j）。 M-スパイダータンパク質とスパイダータンパク質はどちらも、水溶液中では直径 25 nm の球体またはミセルの形で存在します (図 3k)。 37℃で1時間インキュベートした後、クモタンパク質はアミロイドナノフィブリルに変換され、ハイドロゲルを形成しました（図3l、m）。架橋されたM-スパイダーミンハイドロゲルは、より長くて細いナノフィブリルの集合体として現れた（図3n）。

図4 ハイドロゲルの機械的性質

浸透圧ランプ実験では、クモタンパク質とM-クモタンパク質溶液の両方の貯蔵弾性率は温度の上昇とともに増加しましたが、温度が低下しても貯蔵弾性率は以前の値まで低下せず、損失弾性率よりも高いままでした（図4a）。これは、熱的に不可逆で安定したハイドロゲルの形成を示しています。さらに、M-スパイダータンパク質溶液は、可視光制御下で2分以内にハイドロゲルを形成することができました（図4b）。 SEM画像からハイドロゲルの細孔径は約10μmであることが観察された（図4c、d）。 1 rad s−1の一定周波数で実行された振動振幅スイープにより、これらのハイドロゲルサンプルは0.1～5%のひずみ範囲にわたって弾性があることが明らかになりました。しかし、タンパク質濃度が150 mg mL−1から50 mg mL−1に減少すると、線形粘弾性領域は9%から3%にシフトしました（図4e）。ハイドロゲルの機械的強度は、タンパク質濃度を制御することで簡単に調整できます (図 4f)。この研究の結果と比較すると、以前に報告されたゲル化時間はより長く、ゲル化温度は大幅に高く、得られたハイドロゲルは一般に不透明でした（図 4g）。

図5 クモタンパク質ハイドロゲルをバイオインクおよび細胞足場として使用する実証

この研究により、M-スパイダータンパク質がバイオテクノロジーへの応用に適していることがさらに実証されました (図 5)。振動せん断レオロジー分析を使用して、架橋前の M-スパイダーミン/スパイダーミンハイドロゲルの印刷可能性を評価しました。すべての濃度のハイドロゲルは、せん断減粘挙動を示した（図5a）。高いひずみ振動（200％）により、ハイドロゲルはより粘性の高い状態に移行しました（図5b）。 M-スパイダータンパク質/スパイダータンパク質ハイドロゲルは、せん断減粘性と回復特性に基づいて3Dプリントに適しているため、スキャフォールドを印刷し、針のサイズ、印刷速度、圧力に応じて印刷条件を最適化しました（図5c、d）。マウス胎児線維芽細胞を使用して、M-スパイダーミンバイオインクの細胞生存率と増殖能力を評価しました。市販のシルクフィブロインバイオインク（図 5e-g）と比較すると、M-スパイダーミンバイオインクは生存率（> 95%）が高く、シルクバイオインクと同様に増殖します。次に、M-スパイダータンパク質をヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）と混合し、さまざまな処理方法を使用してバイオインクを調製しました。 4つの小さなブロックと1つのハイドロゲルからなる「CITYU」パターンを可視光で硬化させた（図5h）。「CITYU」ハイドロゲルをCD31とHoechstで染色した（図5i）。カルセイン/PI染色を使用して、共焦点顕微鏡で2つのパターン化されたハイドロゲルを観察しました。ナノファイバーネットワーク構造により、培養5日後には90％以上の細胞生存率が観察されました（図5j）。 3D バイオプリンティングでは、細胞を M-スパイダーミン溶液に投入し、押し出す前に 37 °C で 60 分間インキュベートしました。スキャフォールドはロボットアームで印刷され、青色光でさらに硬化されました (図 5k)。免疫染色分析の結果、HUVEC は 7 日目に CD31 を発現していることが確認されました (図 5i–m)。上記の結果は、M-スパイダーミンがさまざまなモデリング手法と互換性があり、細胞の成長と増殖をサポートすることを示しています。

全文の要約<br /> 要約すると、本研究では、構造変換に基づくマイクロ組換えクモタンパク質ハイドロゲルを調製し、これを生物学的 3D 印刷および細胞足場に適用することができます。ゲル化中のクモタンパク質の構造変化のメカニズムが、CD、FTIR、XRD スペクトル、TEM、理論計算によって明らかにされ、検証されました。高濃度の M-スパイダーミン（ミセル構造）はアミロイドナノフィブリルに変換され、ハイドロゲルの形成を誘導し、さらにビスチロシンによって架橋することができます。したがって、M-スパイダーミンは非常に急速にハイドロゲルを形成することができ、架橋ハイドロゲルは調整可能な機械的特性を示します。さらに、この研究では、M-スパイダータンパク質を3Dプリント用のバイオインクとして応用できることも実証されており、ECMに似たナノフィブリルネットワーク構造が細胞増殖を促進できることも示されています。構造変換から生まれた M-スパイダーミンハイドロゲルのコンセプトは、酵素固定、制御された薬物放出、組織工学などの幅広い用途に使用できる高度な特性を備えた機能化ハイドロゲルを作成する可能性を提供します。

ソース：
https://doi.org/10.1002/adfm.202420059

香港城市大学の胡金蓮院士（AFM）：生物学的3Dプリントと生体模倣細胞足場のための組み換えクモタンパク質ハイドロゲル

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