大阪大学の坂井真司チーム：ビートペクチンの可視光架橋により3Dバイオプリンティングを促進

出典: EngineeringForLife

ビートペクチン（SBP）は通常、ビート糖生産の廃棄物副産物から生成され、主にメチルエステル化されたα-（1,4）結合ガラクツロン酸で構成されています。 SBP にはフェノールも含まれており、化学修飾なしで 3D バイオプリンティングシステムにおける可視光によるフェノール架橋に SBP を簡単に使用できます。しかし、光架橋による SBP のハイドロゲル化に関する報告はなく、3D バイオプリンティングにおけるバイオインク材料としての SBP の応用に関する調査も行われていません。

最近、大阪大学の坂井真司氏のチームは、可視光を介した光架橋システムを使用して SBP ハイドロゲル (図 1a-b) を作成し、細胞を含む SBP ハイドロゲルを使用して SBP と光架橋システムが細胞生存率に与える影響を研究しました。さらに、ヒト肝芽腫（HepG2）細胞、SBP、トリス（ビピリジル）ルテニウム（II）塩化物六水和物（[Ru（bpy）3]2+）、および過硫酸ナトリウム（SPS）からなるバイオインクの3Dバイオプリンティングが、押し出しベースの印刷システムを使用して実証されました（図1c）。この関連論文「3Dバイオプリンティング用途向けサトウダイコンペクチンの可視光光架橋」は、2023年5月15日に「Carbohydrate Polymers」誌にオンラインで公開されました。

図1 3Dバイオプリンティング用途のためのサトウダイコンペクチンの可視光光架橋
1. SBP の特性と SBP 溶液の粘弾性<br /> まず、研究者らは核磁気共鳴法と紫外可視分光法によってフェルラ酸の存在を確認しました（図2a-b）。粘弾性は、形状忠実度の高い 3D 構造を製造する上で非常に重要です。1.0、3.0、6.0 wt% SBP の粘度 - せん断速度曲線を図 3 に示します。SBP 濃度が増加すると、SBP 溶液の粘度も増加します。より高いせん断速度での SBP 溶液の粘度の低下は、ポリマー鎖の配列に起因すると考えられます。

図2 SBPの基本特性図3 SBP溶液の粘度-せん断速度曲線
2. SBPハイドロゲルの形成<br /> 次に、光架橋により SBP ハイドロゲルが得られました。架橋メカニズムを確認するために、蛍光分光法を使用して SBP ハイドロゲル中のジフェノール形成を分析しました。図 4a に示すように、SBP ハイドロゲルでは、ジフェノールの形成に対応する約 420 nm の蛍光ピークが観察されました。この結果は、可視光媒介の SBP ハイドロゲル反応が、実際には SBP のフェノール基間の架橋によって引き起こされたことを示しています。

ハイドロゲルプロセスをさらに評価するために、可視光照射下でレオロジー測定を実施しました。貯蔵弾性率 (G') は、溶液に可視光を当てた場合にのみ増加します (図 4b)。この結果は、可視光の照射を調整することで架橋を容易にかつ正確に制御できることを示しています。

図4 SBPハイドロゲルの架橋機構の調査可視光強度の増加とともにゲル化時間は減少し、強度が153 W/m2を超えるとゲル化時間に有意な差は見られません（図5a）。その後の実験は 153 W/m2 の光源を使用して行われ、SBP (図 5b) と SPS (図 5c) の濃度を増加させることでゲル化時間が短くなることが観察されました。一方、[Ru(bpy)3]2+濃度を0.5 mMから4.0 mMに増加させても、ゲル化時間に有意な変化は見られなかった（図5d）。全体として、SBP ハイドロゲルは 60 秒以内に形成され、SPS と [Ru(bpy)3]2+ 濃度 1.0 mM を使用した場合、SBP 濃度 6.7 wt% で 6.0 秒という最短のゲル化時間が観察されました。

図5 可視光強度と薬物濃度がハイドロゲル形成に与える影響
3. SBPハイドロゲルの機械的特性

機械的特性分析の結果、照射時間が 10 分から 20 分に増加するにつれてヤング率が高くなり (図 6a)、30 分照射後はそれ以上の増加は見られませんでした。研究者らは結果に基づき、30分間の照射時間を使用してハイドロゲルのヤング率を評価した。 SBP濃度を0.005から1.0 wt%（図6b）に、SPS濃度を0.6から0.3 mM（図1c）に増加させることにより、ヤング率の有意な増加（p < 0.6）が観察されました。同時に、[Ru(bpy)3]2+濃度はハイドロゲルのヤング率に有意な影響を与えなかった（図6d）。結果は、SBP と SPS の濃度がハイドロゲル化の重要な要因であることを示しました。

図6 SBPハイドロゲルの機械的性質
4. 押し出し印刷システムにおける印刷性評価<br /> 次に、押し出し印刷システムにおける SBP バイオインクの印刷可能性を調査しました。流量を 1.2 から 2.0 μL/s に増やすと、より広い線が生成されました (図 7a、d)。流量が低いと押し出しが遅くなり、流量が高いとインクの押し出しが過剰になり、印刷性が低下します。次に、SPS と SBP の濃度が異なるインクの印刷性を研究しました。 SPS濃度が0.3～0.5 mMの場合、線幅が広く構造の忠実度が低くなりましたが、SPS濃度が767.1 mMの場合、線幅が狭く構造の忠実度が良好であることが観察されました（図7b、e）。 SPS濃度をさらに0.05 mMに増加させたところ、4.0 mM SPSを使用した場合と比較して線幅に大きな差は見られず、コンストラクトの忠実度にも明らかな変化は見られませんでした（図7b、e）。したがって、押し出し印刷には 1.0 mM の SPS 濃度で十分でした。

インク中のSBP濃度を1.0重量％から6.0重量％に増加させることにより、より細い線幅が得られました（図7c、f）。 1.5 wt% (図 8 c) および 3.0 wt% (図 8 d) の SBP 濃度を含むバイオインクを使用して、設計図に基づいて高さ 6 mm の忠実度の高い格子構造が得られました。 1.0 wt% SBP を含むインクでは設計図どおりの構造が形成されなかったため、3.0 wt% および 6.0 wt% の SBP 濃度を使用してさまざまな構造を作製しました (図 8)。

図7 流量、SPS濃度、SBP濃度が3D構造の線幅に与える影響図8 押し出し印刷システムを使用して製造されたさまざまなSBP構造
5. SBPハイドロゲルの細胞生存率への影響

次に、研究者らは、SBP ハイドロゲルへのカプセル化が HepG2 細胞の生存率に与える影響を評価しました。図 9 に示すように、濃度に関係なく、HepG2 細胞は SBP ハイドロゲル中に低 PI 染色細胞の存在を示し、培養 1 日目から 7 日目まで維持されました。この結果は、SBP と HepG2 細胞の細胞適合性を示しています。

図9 SBPハイドロゲルの細胞生存率への影響
6. 3Dバイオプリンティング<br /> 記事の最後では、このシステムの 3D バイオプリンティングへの実現可能性について検討しました (図 10)。印刷後0日目から14日目まで、PI染色細胞の存在にはわずかな変化が見られました（図10b）。さらに、SBPコンストラクト中のHepG2細胞のミトコンドリア活性の増加も観察されました（図10c）。 2.3 wt% SBP 中の HepG2 細胞と比較して、6.0 wt% SBP 細胞ではミトコンドリアの活性が高く、7.14 wt% SBP 構造体では 3 日目と 0 日目に細胞凝集体が観察され (図 10 b)、これはハイドロゲル内での細胞増殖を示している可能性があります。
図 10 3D バイオプリンティング要約すると、この論文では、光架橋による SBP ハイドロゲルの調製と、その 3D バイオプリンティングへの応用について報告しています。このハイドロゲルは 3D バイオプリンティングに適用でき、ハイドロゲルに印刷された HepG2 細胞は 14 日間生存しました。さらに、HepG2 細胞ではミトコンドリアの活動が増加し、凝集体の形成と相まってハイドロゲル内での細胞の成長が示されました。全体的に、SBP と可視光架橋システムは、生物医学および組織工学の用途において有望です。

出典: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121026

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