3Dバイオプリンティングの進歩のレビュー：印刷方法からバイオメディカルアプリケーションまで

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

過去数十年にわたり、バイオ 3D プリントは、皮膚、血管、心臓など、多くの組織や臓器のプロトタイプを作成するために広く使用されてきました。これは、臓器の置換という壮大な目標の基礎を築くだけでなく、薬物スクリーニング、臓器の開発、病理学に役立つ in vitro 病理モデルとしても使用できます。臓器/組織の複雑な構造を考慮して、さまざまな応用シナリオに合わせて多種多様な生物学的 3D プリント方法が開発されてきました。アプリケーション要件に基づいて適切なバイオプリンティング方法を選択するにはどうすればよいでしょうか?このレビューでは、バイオ3Dプリンティングの発展、プロセスフロー、分類を体系的にレビューし、プリンティングの基本原理と市販のバイオプリンティング機器に焦点を当て、押し出し、液滴、光硬化バイオ3Dプリンティングをまとめ、分類し、その応用に関する提案を行いました。今後広く使用されるバイオ3Dプリンティング技術は、投影光硬化プリンティング、懸垂支持プリンティング、同軸プリンティングの3つであると考えています。バイオインクの設計における重要なポイントは、印刷性、生体適合性、機械的特性のバランスを見つけることです。

「3Dバイオプリンティングの開発：印刷方法からバイオメディカルアプリケーションまで」と題する関連レビューが、アジア薬学ジャーナルにオンラインで掲載されました。第一著者は博士課程の学生である顧澤明氏、責任著者はHe Yong教授です。

生物学的 3D プリント技術には、まだ改善の余地がたくさんあると考えています。組織や臓器の複雑さにより、精密なバイオプリンティングは困難を極めます。この問題を解決するために、マルチサイズ、マルチマテリアル、マルチセルのバイオプリンティングが今後の開発の焦点となるでしょう。天然の組織/臓器と比較すると、バイオプリンティングの精度が低いことが、現在のバイオプリンティング技術の主な欠点の 1 つです。もう一つの一般的な欠点は、特に複数の材料を交互に印刷する場合に、大きく複雑な構造の印刷速度が遅いことです。さらに、生物学的 3D プリンティングの主要な用途である in vitro 組織モデルは、サイズだけでなく生体適合性や機械的特性も標準化する必要があり、バイオプリンティング技術の均一性と再現性に対する要件がさらに高くなります。他の印刷方法と比較して、投影光硬化生物学的 3D 印刷技術はこれらの点でかなりの利点があります。

バイオインクの開発と応用はバイオプリンティング技術の鍵となります。印刷性、生体適合性、機械的特性のバランスをとることができる新しいバイオインクの研究、開発、安定した合成は、生物学的 3D プリンティングの応用の基礎となります。現在行われている多くの研究は、依然として限られた範囲の生体材料の使用に限られていますが、ほとんどの人間の組織/臓器は、特定の生物学的または機械的効果を持つ ECM 成分の複雑な組み合わせを持っています。単一のバイオインクでは、体内の実際の状況をシミュレートする「合成」微小環境を確立できないため、マルチマテリアルバイオプリンティングがますます重要になっています。

血管新生は生体構造のバイオプリンティングの基本です。組織工学や再生医療の分野で直面している課題と同様に、印刷された構造の適切な血管新生を確保することは、3D バイオプリンティングの重要な要素です。マルチスケールの灌流血管ネットワークを効果的に構築し、機械的または化学的刺激を通じて血管新生を促進することは、スケールアップされた組織のバイオ製造の基礎となります。血管ネットワークを構築する方法は数多くありますが、それぞれの方法には限界があります。例えば、インクジェットバイオプリンティングや実験室印刷は解像度が高いものの、複雑な血管ネットワークを構築することが困難です。犠牲材料に基づくバイオプリンティングには複雑な二次成形プロセスが必要です。同軸バイオプリンティングは、多様なサイズの流路を構築できる可能性と灌流培養の能力があり、血管形成の分野で幅広い応用の見通しがあります。

機能化を実現することが 3D バイオプリンティングの主な目的です。現在の研究のほとんどは、依然として製造業向けのアイデアである印刷プロセスとメカニズムに焦点を当てていますが、生物学的 3D 印刷の機能化の中核となる要素は、基礎研究から実際のアプリケーションに移行することです。機能化を実現するには、バイオインクは栄養灌流と移植の要件を満たす優れた生体適合性と機械的特性を備えている必要があります。同時に、機械的刺激や化学的刺激を含む生体内微小環境をシミュレートするシナリオを構築することも、印刷された構造の機能化にとって重要です。

3D プリントは、ジャガイモを切ることの逆のプロセスのようなものです。ジャガイモを切ることは、ジャガイモをジャガイモのスライス、ジャガイモのシュレッド、ジャガイモのダイス、またはマッシュポテトに加工することであり、3D プリントは、ジャガイモのスライス、ジャガイモのシュレッド、ジャガイモのダイス、またはマッシュポテトを逆にジャガイモに組み立てるプロセスです。これらの 4 つのプロセスは、組み立てに投影光重合を使用するデジタル光処理 (DLP)、組み立てに繊維スタッキングを使用する熱溶解積層法 (FDM)、組み立てにマイクロスフィアを使用するインクジェット印刷、組み立てに粉末焼結を使用する選択的レーザー焼結法 (SLS) という 4 つの一般的な 3D プリントプロセスに対応しています (図 1)。

バイオ 3D プリンティングは、力学、材料、生物学、医学など複数の分野に密接に関連する最先端技術です。広義では、バイオメディカル分野に直接役立つ 3D プリンティングはすべて、生物学的 3D プリンティングの一部と見なすことができます。狭義では、細胞を含むバイオインクを操作して活性構造を構築するプロセスは通常、生物学的 3D プリンティングと呼ばれ、この概念は細胞プリンティングとも呼ばれます。生物系3Dプリンティングの開発経緯（図2）とプロセスフロー（図3）を体系的にまとめました。

図1 4つの典型的な3Dプリントプロセスに対応する4つのジャガイモ切断方法

図2 3Dバイオプリンティングの概要

図3 生物学的3Dプリントのプロセスフロー

さまざまな印刷原理と印刷材料に基づいて、生物学的 3D 印刷の分類を整理し、一般的な生物学的 3D 印刷方法を、押し出し、液滴、光硬化の 3 つのカテゴリに分けました。簡単に言うと、押し出しバイオプリンティングはバイオインクを押し出して連続繊維を形成することで構造を構築します。液滴バイオプリンティングは個別の液滴を生成してスタックを形成します。光硬化バイオプリンティングは感光性材料を使用して硬化し、層ごとに積み重ねて 3 次元モデルを実現します。押し出しバイオプリンティングは、液体の排出方法の違いにより、空気圧押し出し、ピストン押し出し、スパイラル押し出しの 3 つのタイプに分けられます (図 4)。

図4 押し出しバイオプリンティングの原理

さまざまな液滴形成原理に応じて、液滴バイオプリンティングはインクジェット、電気流体力学ジェット (EHDJ)、レーザー支援 (LAB) タイプに分類できます。その中で、一般的なインクジェットバイオプリンティングのタイプには、熱バブルタイプと圧電タイプがあり、レーザーアシストバイオプリンティングはさらに、レーザー誘導直接書き込み（LGDW）とレーザー誘起前方転写（LIFT）に分類されます（図5）。

図5 液滴バイオプリンティングの原理

光硬化バイオプリンティングは、光スキャン方法の違いにより、ステレオリソグラフィー (SLA) とデジタル光処理 (DLP) に分けられます。現在、SLA 技術はスキャフォールド印刷で広く使用されていますが、細胞をロードした印刷への応用はまれです。 DLP 技術は、高い印刷精度、高速性、優れた均一性などの利点があるため、学術界からますます注目を集めています (図 6)。

図6 DLP印刷原理

皮膚、骨/軟骨、神経、筋肉/腱、脂肪、脊髄、血管/血管新生、オルガノイド、薬物研究/腫瘍モデル、臨床応用における現在の研究状況など、バイオメディカル分野におけるさまざまなバイオプリンティング方法の応用について詳しく説明します。また、市場でよく知られている市販のバイオプリンティング機器の概要と概要を説明し、現在人気のマルチマテリアルバイオプリンティング（図7）と同軸バイオプリンティング（図8）についても詳しく説明します。

図7 マルチマテリアルバイオプリンティングの応用

図8 同軸バイオプリンティングの応用

さまざまな応用シナリオを対象にさまざまなバイオプリンティング方法が発明されており、それに応じて、各バイオプリンティング方法には独自の長所と短所があります。

押し出しバイオプリンティングは現在、最も広く使用されているバイオプリンティング方法です。その最大の利点は、印刷可能な生体適合性材料（細胞クラスター、細胞含有ハイドロゲル、マイクロキャリア、脱細胞化マトリックス成分など）の範囲が広いことであり、特にせん断減粘性と急速な架橋特性を持つハイドロゲル材料など、粘度が 30 mPa/s から 6×10^7 mPa/s の生体材料をカバーしています。これは、細胞の生存と機能化を維持するために適切な微小環境を提供できる低粘度材料と、印刷された構造に機械的サポートを提供できる高粘度材料を、押し出しバイオプリンティングとうまく組み合わせることができることを意味します。同時に、押し出しバイオプリンティングは経済性と使いやすさに優れているという利点もあり、マルチマテリアルおよび同軸バイオプリンティングと密接に組み合わせることができます。しかし、押し出しバイオプリンティングにも欠点があります。第一に、印刷精度は他のバイオプリンティング方法よりも低く、一般的には 100μm 程度です。第二に、バイオインクの選択では、ゲル化、凝固、せん断減粘などの特性を考慮する必要があります。さらに、押し出しプロセス中に避けられないせん断力が細胞の生存率に影響を与える可能性があり、これは細胞密度の高いバイオインクを印刷する場合に顕著になります。

インクジェットバイオプリンティングは、低コスト、高精度、高速という利点があり、複数のノズルを装備して、異なる細胞、生体材料、成長因子を同時に印刷するニーズを満たすこともできます。しかし、インクジェット印刷で使用されるバイオインクの粘度要件により、適用可能なバイオマテリアルの範囲が制限されます。駆動圧力が低いため、インクジェットバイオプリンティングでは高粘度の材料や高濃度の細胞を印刷できません。現在、インクジェット技術を使用して生理学的細胞密度のバイオプリンティングを実現することは困難であり、低粘度の材料は印刷された成形品の構造強度を低下させ、その後の体外培養および移植の要件を満たせなくなります。さらに、インクジェット印刷プロセスは細胞に機械的または熱的損傷を引き起こす可能性があり、ノズルも摩耗しやすくなります。これらの欠点により、インクジェットバイオプリンティング技術の広範な応用が制限されています。

レーザーアシストバイオプリンティングは、前述の 2 つの方法に比べて固有の利点があります。ノズルフリー印刷モードにより、細胞/生体材料がノズルを詰まらせる問題を回避できます。同時に、バイオインクとデバイス間の直接接触も回避できます。この非接触製造方法は、細胞に機械的な損傷を与えません。高粘度バイオインクを印刷するための生体材料の範囲はインクジェット印刷よりも広く、印刷精度は単一細胞を含む液滴を生成できるレベルにまで達します。しかし、レーザー支援バイオプリンティングには、いくつかの明らかな欠点があります。第一に、コストが比較的高く、市販の印刷機器が不足しており、レーザーバイオプリンティングに適したハイドロゲル材料があまりありません。第二に、この方法は高度に自動化されていません。LIFT原理で説明されているように、インクの各層は繰り返し塗布されるため、均一性が保証されないだけでなく、時間がかかり、労働集約的であるため、複雑な構造の印刷には適用が困難です。

DLP は表面投影に基づく生物学的 3D 印刷方法であり、広く使用されている押し出し印刷よりも高い印刷解像度と再現性を備えています。 DLP の成形原理によれば、構造がどんなに複雑であっても各層の印刷時間が増加しないため、印刷速度に大きな利点があります。さらに、インクジェットバイオプリンティングにおける液滴間や押し出し印刷における隣接する繊維間に形成される「境界」と比較して、DLP技術は3次元構造をより滑らかに積み重ねることができるため、構造の完全性と機械的特性が大幅に向上します。光硬化印刷プロセスでは、未硬化の液体バイオインクが印刷構造に良好なサポートを提供し、印刷プロセス中のハイドロゲルの崩壊や変形を回避できます。LABと同様に、ノズルフリー印刷モードは、ノズルの詰まりや細胞活動に影響を与えるせん断力などの問題がなくなることを意味します。光硬化バイオプリンティング技術は細胞バイオプリンティング技術においてますます重要な役割を果たし、将来的には押し出しバイオプリンティングに取って代わり、最も主流の生物学的3Dプリンティング技術になると期待されています。

バイオインクの性能は、印刷性、生体適合性、機械的特性という3つの側面から大まかに評価できます（図9）。印刷可能性は、調整可能な生体材料の粘度、ゾルからゲル状態への急速な変換特性、および広範囲の印刷可能なパラメータを含むバイオインクの成形可能性の評価です。生体適合性を確保するには、バイオインクが人体の細胞微小環境に可能な限り類似し、その中で細胞が増殖、拡大、分化、相互作用できるようにする必要があります。機械的特性には、ゲル状態のバイオインクの機械的特性が、その後の培養および移植プロセスをサポートするために強力であることが必要です。バイオプリントされた構造は通常、体外で培養する必要があり、その間に栄養素の注入と分解が伴うことが多いため、かなりの強度サポートが必要です。機械的特性が不十分な場合も、移植の失敗につながる可能性があります。

図9 バイオインクの性能評価基準

ソース：
https://doi.org/10.1016/j.ajps.2019.11.003

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