ハーバード大学 | ゼラチン繊維が3Dプリントされた心室の心筋細胞の配置を誘導

出典: GK グリーンキーバイオテック

ハーバード大学のケビン・キット・パーカー教授のチームは、ネイチャー・マテリアルズ誌に「繊維注入ゲル足場が3Dプリント心室の心筋細胞の配列を誘導」と題する論文を発表した。チームは心臓の細胞内および細胞間組織を再現する3D臓器レベルの足場を印刷するための、プレファブリケーションされたゼラチン繊維を含むハイドロゲルインクを開発した。著者らは、あらかじめ製造されたゼラチン繊維をハイドロゲルに追加することで、インクのレオロジーを制御し、制御されたゾル-ゲル転移を実現し、追加のサポート材料を必要とせずに自立型 3D 構造の精密印刷を可能にします。インク押し出しプロセス中、せん断誘起繊維配列により、培養されたヒト心筋細胞の異方性筋組織への自己組織化を促進するマイクロスケールの幾何学的手がかりが提供され、3D プリントされた心室の in vitro モデルは、生体模倣の異方性電気生理学的および収縮特性を備えています。

何ですか——ゼラチン繊維とは何ですか?

ゼラチン繊維は、通常ゼラチンから作られる合成繊維で、天然コラーゲン繊維に匹敵します。そのサイズは通常 1.3 μm ～ 8.7 μm です。この繊維は優れた機械的特性と特定の細胞との良好な適合性を備えています。ゼラチン繊維と繊維表面との相互作用原理には物理的相互作用と化学的相互作用が含まれており、繊維間の接触面積を増やし、結合の強度を向上させることができます。
なぜ——なぜ心臓組織を作成するのに 3D バイオプリンティングを使用するのでしょうか?

現在、研究者は、マイクロコンタクトプリンティング、リソグラフィー、方向性凍結乾燥、繊維紡糸、およびマイクロ生理学的チップ製造を通じて心臓組織を設計する傾向がありますが、これらの方法では、心臓機能を完全に再現する複雑な幾何学的組織を生成する能力に限界があります。生物学的 3D プリントの利点は、細胞や組織の元の構造を正確に複製できる、複雑で生体適合性の高い構造を生成できることです。
方法 – 著者らは、ゼラチン繊維をゼラチンとアルギン酸（Gel-Alg）ハイドロゲルマトリックスに注入してインクを設計しました。

図 1. 細胞配列の手がかりを備えた自立型 3D プリント組織スキャフォールドを印刷するためのゼラチンインクの開発。ハイドロゲルに繊維を組み込むと、インクのレオロジーが変わり、サポート構造や材料なしで精密で複雑な 3D スキャフォールドを作成できます。ゼラチンマイクロファイバーの形状を整え、位相的および化学的手がかりを組み合わせることで、印刷された 3D 心室スキャフォールドは、心筋細胞の異方性筋組織への自己組織化を促進することができます。繊維注入ゲル (FIG) インクを製造した後、著者らはゼラチン繊維と Gel-Alg ハイドロゲルで構成された 3D スキャフォールドを印刷しました。印刷プロセス中、ノズルのせん断応力は弾性のある FIG インクを液体に変えるのに十分な大きさであり、その後、圧縮されると弾性安定性が回復します。これらの非線形レオロジー特性により、FIG インクの連続押し出しが可能になり、サポート構造として犠牲層や槽を必要とせずに複雑な形状の層状構造を印刷できるようになり、自立型中空 3D 構造が実現します。要約すると、ゲル状 FIG インクの高い弾性率は、足場や犠牲浴を必要とせずに、厚さ 200 μm ～ 350 μm の自立型壁を印刷するのに十分なゲル安定性を提供します。

図 2 ゼラチン繊維灌流ゲルの印刷された足場上で培養された心臓組織の異方性細胞内および細胞間組織化 FIG インク印刷された足場が心筋細胞の細胞内および細胞間組織化、筋原線維組織化および配列を強化する能力を評価するために、著者らは、印刷された 2 次元 (2D) FIG 足場上に新生児ラット心室心筋細胞 (NRVM) を播種しました。その結果、多形性培養条件と比較して同等の細胞生存率を維持した、高度に整列した心臓組織が形成されました。次に、筋節α-アクチンと細胞骨格アクチンフィラメント（F-アクチン）の配列を定量化する配向秩序パラメータ（OOP）を計算することにより、構造組織における異方性の程度を測定しました。細胞内および細胞間の骨格構造によって生成されるプレストレスが、細胞核の伸長と配向を決定します。対照となる Gel-Alg スキャフォールド上の細胞核と比較すると、FIG スキャフォールド上の細胞核は伸長しており、NRVM の核配向も印刷方向 (0°) に沿って整列していますが、Gel-Alg スキャフォールドの核配向には特定の配向がありません。

図 3 多方向異方性心臓組織の電気機械結合ダイナミクス FIG が心筋細胞を繊維構造に沿って自己組織化し、心臓機能シンシチウムを形成する能力をテストするために、著者らは細胞間接合構造の機能的結果とその電気生理学的特性を測定した。著者らは、光学マッピングを使用して、印刷方向に対する縦軸と横軸に沿った心臓のインパルス伝導の指標としてカルシウム (Ca2+) の過渡伝播を測定しました。最後に、結果は、FIG スキャフォールド上の心臓組織が 6 cm の蛇行パターンで Ca2+ 波を伝播し、印刷方向に沿って強い電気的結合を示していることを示しました。 NRVMとヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（hiPSC-CM）を使用してFIGスキャフォールド上に構築された心臓組織の横方向および縦方向の伝播速度値は、それぞれ1.67±0.085と1.62±0.18でした。対照的に、繊維のないコントロールスキャフォールド上の NRVM 組織の伝播速度比は 1 に近かった。心筋細胞は印刷方向に沿って優先的に電気機械的に結合し、電気刺激を受けて周期的な変形を起こすことができます。また、スキャフォールド内の配置方向が交互に変わることで、心筋細胞の組織化が局所的な繊維方向に沿っていることが示され、その結果、対応する局所的な組織収縮パターンが生まれます。

図 4 ヒト幹細胞組織工学に基づく 3 次元心室モデルの構造的、電気生理学的、および収縮特性著者らは、3D プリントされた心室スキャフォールド上で NRVM と hiPSC-CM を培養し、繊維を円周方向に配置し、3 次元心室の形状で層状の異方性心臓組織を形成しました。体外心室モデルは、自発心拍数が 1 秒あたり約 0.71 回で 14 日間培養されました。これは、足場が 800,000 サイクル以上の機械的負荷に対して目立った劣化なく耐久性があることを示しています。 NRVM 培養心室モデルに点電気刺激を与えた後、著者らは Ca2+ の一時的な伝播が縦方向よりも横方向 (印刷方向) で速いことを観察しました。これにより、3D プリントされた心室スキャフォールド内のインパルス伝播も、印刷方向によって決定される組織配列に沿って発生することが確認されました。 hiPSC-CM 心室モデルの収縮性能を評価するために、著者らは粒子画像流速測定法 (PIV) を使用して基底開口部での流体力学的出力を測定しました。粒子の流れの方向と速度により、収縮および弛緩中の流体運動の質量流束を推定することができました。最後に、hiPSC-CM培養心室モデルの最大収縮と最大弛緩の間の心室容積の変化は5.94±1.66％と計算され、これは以前に報告されたNRVMとhiPSC-CMのin vitro心室モデルの値（駆出率）よりもそれぞれ2〜5倍と8〜20倍高かった。

結論: 著者らは、心臓の微細構造の ECM アーキテクチャとマクロ構造の臓器レベルの形状を同時に再現するハイドロゲルベースの FIG インクを使用して、組織工学による心室モデルを 3D プリントできることを実証しました。注入されたゼラチン繊維はハイドロゲルインクのレオロジー改質剤として機能し、犠牲浴を使用せずに複雑な 3D オブジェクトの印刷を可能にします。これらの繊維は、細胞接着と機能的な合胞体への自己組織化を促進する生化学的および微細構造的な手がかりも提供します。この研究は、FIG インク印刷が、微細構造の正確さで本来の臓器の形状を再現する標準化されたアクセス可能なバイオプリンティングプロセスを促進する上で重要な役割を果たすことを示しています。

オリジナルリンク: https://doi.org/10.1038/s41563-023-01611-3

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