軟骨組織工学における3Dプリントの応用

著者: Yu Shuying、Li Yucheng、Xinhao、Zhang Yijun、Liu Zheng、Yan Chengxiang、Xie Baihui、Wang Ximei 出典: Chinese Journal of Plastic Surgery、Vol. 40、No. 1、2024年1月著者の所属部署: 鄭州大学第一付属病院形成外科、鄭州 450000
連絡先著者: 王希美、メールアドレス: [email protected]

過去数十年にわたり、軟骨再生は驚異的な進歩を遂げてきました。組織工学軟骨スキャフォールドを構築するための従来の技術には、主にポロゲン法（またはテンプレート法）、相分離法、ガス発泡法、凍結乾燥法、電界紡糸法などがあります。軟骨は不均質であり、従来のスキャフォールドでは軟骨の高度に異方的な構造をシミュレートすることは困難です。したがって、軟骨の機能的再生は困難です。 3次元印刷技術の進歩により、生体材料、細胞、活性生体分子の共堆積を通じて微細構造と勾配変化を備えた機能的なバイオニックススキャフォールドを作製することが可能になり、機能的な軟骨再生が実現しました。この記事では、3D プリント技術と、さまざまな解剖学的部位 (関節、耳介、鼻) における軟骨再生へのその応用について詳しく説明します。さらに、局所的な構造勾配と局所的な組成勾配を備えた生体模倣構造を準備することの重要性についても議論します。 3次元バイオプリンティング、4次元プリンティング技術、スマート材料は、バイオニック組織や臓器の構築に希望をもたらしました。

軟骨組織工学は、材料科学、細胞生物学、工学などを統合した学際的な研究分野です。材料科学、細胞生物学、3次元印刷技術の継続的な進歩により、軟骨組織工学もここ数十年で急速に発展しました[1]。軟骨組織工学には、足場、種子細胞、成長因子という3つの典型的な要素が含まれます[2]。この技術では、主に自己軟骨細胞または成体幹細胞を種子細胞として使用します。種子細胞は、3次元多孔質構造を持つ生分解性足場材料に接種されます。成長因子の誘導により、種子細胞は適切な分化制御を受け、軟骨または軟骨様組織を形成します[3]。軟骨スキャフォールドは、種子細胞の拡散と増殖をサポートするとともに、軟骨や軟骨様組織の再生と再構築に適した空間を提供し、軟骨組織工学において重要な役割を果たしています。軟骨組織工学のための理想的なスキャフォールド材料は、以下の特性を備えている必要があります。(1) 生体適合性、その上に移植されたシード細胞の増殖、分化、成熟をサポートします。(2) 分解性、つまり移植後、スキャフォールドは時間の経過とともにゆっくりと分解し、細胞が新しい軟骨マトリックスを生成してスキャフォールド材料を置き換え、再生された軟骨組織がそれを置き換えることができることを意味します [4]。(3) 生体力学的特性、つまり軟骨の形状を安定して維持でき、修復される軟骨組織の機械的特性と一致することを意味します。(4) パーソナライゼーション、つまりスキャフォールドの形状が修復領域に一致するか、さまざまな所望の形状に簡単に成形できることを意味します。(5) 適切な多孔性、つまり分子、栄養素、酸素の移動と拡散を可能にします [5]。

軟骨スキャフォールドを作製する従来の方法には、ポロゲン法（またはテンプレート法）、相分離法、ガス発泡法、凍結乾燥法、電界紡糸法などがあり、これらは簡便で経済的という利点がある一方で、スキャフォールドの微細構造を柔軟に設計して精密に制御することが難しい、損傷部位と高度に一致するスキャフォールド形状を個別に製造することが難しい、不均一な特性を持つスキャフォールド（二相および多相スキャフォールド）を構築することが難しいなどの欠点もあります。近年、3次元印刷技術が急速に発展しており、コンピュータ支援成形に基づいて、スキャフォールドのマクロ的な形状とミクロ的な特性を正確に構築および制御し、良好な適合性、形態、適切な機械的強度を備えた軟骨バイオニック勾配スキャフォールドを形成し、最終的に軟骨および軟骨様組織の個別化された修復と再生を実現することができます[6、7]。したがって、軟骨組織工学の分野における 3D プリント技術の応用には、幅広い発展の見込みがあります。この記事では、軟骨組織工学のシード細胞、足場材料、3D プリント技術、およびさまざまな解剖学的部位 (関節軟骨、耳介、鼻) での軟骨再生における 3D プリント技術の応用について詳しく紹介します。さらに、局所的な構造勾配と局所的な組成勾配を持つバイオニック構造物の製造方法についても議論されました。3次元バイオプリンティング技術、4次元プリンティング、スマート材料は、バイオニック組織や臓器の構築に希望をもたらしました。

1. 3Dプリント技術
（I）3D印刷技術のいくつかの方法 3D印刷技術は、ラピッドプロトタイピング技術であり、積層造形とも呼ばれています。これは、デジタルモデルファイルを基礎として、粉末金属やプラスチックなどの接着可能な材料を使用して、層ごとに印刷することでオブジェクトを構築する技術です[1]。 CT、MRI、表面スキャン、3D写真などの画像技術を組み合わせ、コンピュータ支援設計（CAD）およびコンピュータ支援製造（CAM）技術を使用することで、対象の軟骨形状データを3Dプリントデジタルモデルファイルに変換し、3Dプリント技術を通じて軟骨構造の形状を正確にカスタマイズして、理想的な組織工学軟骨を取得します。一般的な3Dプリンティング方法には、熱溶解積層法（FDM）、ステレオリソグラフィー、低温積層法（LDM）、選択的レーザー焼結法（SLS）、3次元印刷（3DP）、電子ビーム自由造形法（EBF）、直接金属レーザー焼結法（DMLS）、電子ビーム溶融法（EBM）、選択的レーザー溶融法（SLM）、選択的熱焼結法（SHS）などがあります[8、9]。以下では主にFDM、ステレオリソグラフィー、LDM、SLSについて紹介します。

1.ファジィ
FDM は最も一般的に使用されている 3D 印刷技術です。 FDM の原理は、高温で溶融した押し出しポリマー材料がコンピューターで精密に制御された経路でノズルを通過した後、層ごとの印刷プロセス中に材料が適切な形状を形成するというものです (図 1)。 FDM は、高度に相互接続された細孔形状とチャネル寸法を備えたスキャフォールドを迅速に製造できます。押し出し圧力、ノズル径、堆積速度などのプロセスパラメータを変更することで、さまざまなフィラメント径と多孔度を持つスキャフォールドを印刷できます。 FDMは通常、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸などの熱可塑性ポリマーの成形、およびいくつかの温度に敏感な材料の印刷に適しています。柔軟な材料処理と適用、高い印刷構造精度、およびスキャフォールドの理想的な機械的強度が特徴です。さまざまな軟骨スキャフォールドを構築でき、3Dプリントで広く使用されています。しかし、FDMの処理温度が高いため、FDM材料は加熱された状態になり、印刷プロセス中に細胞が生存できず、バイオプリンティングには適していません[8]。

2.ステレオリソグラフィーステレオリソグラフィーには、ステレオリソグラフィー (SLA) とデジタル光処理 (DLP) 技術が含まれます。これは、感光性材料が光源によって照射された後に急速に固化し、層ごとに堆積され、最終的に 3 次元印刷を実現するプロセスです。ステレオリソグラフィーはノズルアプローチではなく、液体材料を樹脂浴に入れ、ビルドプレートを下げて光源がプログラムされたパターンに沿って進み、設計された部分のみを架橋します。このプロセスにより、物体が形成されるまで材料を層ごとに堆積させることができ[10]、他の技術で一般的に見られる細胞へのせん断応力を回避できます。 SLA と DLP 技術の違いは、使用される光源です。SLA はレーザーを使用し、DLP はプロジェクターからの光を使用します。レーザーシステムは感光性材料を点ごとに選択的に架橋させるのに対し、DLPシステムはダイナミックミラーアレイを使用して領域に選択的に光を投影し、各層に割り当てられたすべての点を架橋させます[11]。 SLA または DLP は感光性ポリマー原料に基づいており、より高い構造精度と安定性を実現できます。SLA 3 次元成形は、最も成熟度が高く、成形速度が速く、寸法精度が高いため、感光性ハイドロゲル (二重結合修飾ゼラチンやヒアルロン酸など) が軟骨スキャフォールドやバイオプリンティングを構築するのに適しています。メタクリル化アルギン酸、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどの一般的に使用される感光性ハイドロゲル材料は、軟骨組織工学構築に使用することができます[12]。

3. LDMC
LDMは制御された冷却チャンバーを使用して、堆積プロセス中に複合スラリーまたは溶液を低温に保ちます[13]。 LDMはポリマースラリー、混合生体材料、ポリマーの印刷に適しています。高精度の複合スラリー堆積を実現し、凍結乾燥により材料表面に微細孔を形成できます。ただし、LDMでは構造物に残留有機溶媒が残る可能性があります[9]。

4.セルス
SLS は、コンピューター制御によるレーザースキャンを使用して、作業プラットフォーム上で粉末材料を溶かして結合する技術です。 1 つの層をスキャンすると、固化した層の表面に新しい粉末材料の層が適用され、層ごとにスキャンされて結合され、3 次元構造が作成されます。 SLS は主に金属粉末、プラスチック、セラミックの印刷に適しています。 SLS はサポート材の使用を必要とせず、処理速度が速いですが、継続的な高温によりポリマー材料の劣化が発生する可能性があり、製品表面が粗くなり後処理が必要になり、処理中に粉塵や有毒ガスが発生します。したがって、SLSはハイドロゲル成形には適していない[9]。

（２）３次元バイオプリンティング３次元バイオプリンティングは、多くの３次元プリンティング技術の１つの分野であり、組織工学や再生医療のための高度な補助技術でもある[14, 15]。現在、軟骨スキャフォールドの印刷には 3D 印刷技術が広く使用されていますが、材料特性と成形条件の制限により、軟骨スキャフォールドを印刷した後にシード細胞を接種する必要があります。 3次元バイオプリンティングでは、生きた細胞と足場材料をバイオインクとして使用して同時に印刷し、最終的に生理機能を備えた組織や臓器を形成します。従来の 3D 印刷技術では、軟骨スキャフォールドに接種された種子細胞の空間分布を正確に制御することができず、構築された微小環境は生体内のものとは大きく異なります。 3次元バイオプリンティングは、従来の3次元プリンティングの欠点を補い、細胞分布を正確に制御し、機械的および化学的特性を調整し、天然軟骨の解剖学的構造と生理学的機能をよりよくシミュレートすることができます[9、16]。これにより、複雑な構造（骨軟骨区画など）やさまざまな種類の軟骨（硝子軟骨、線維軟骨、弾性軟骨）を活用し、特定の患者のニーズに応じた個別化医療の構築など、多くの新しい展望が開かれます。 3Dバイオプリンティングの重要な要素は、バイオインクの設計にあります。従来の軟骨スキャフォールドの3Dプリンティングでは、生きた細胞がないため、選択できる印刷方法が多く、印刷条件は凍結、加熱、高強度光架橋など比較的厳しい場合があります。従来の3Dプリンティングで選択できる印刷インクは、ハイドロゲルの水溶液、有機溶液、熱可塑性ポリマーの溶融スラリーなど、比較的幅広くなっています。従来の3Dプリンティングで制御できる印刷インクのパラメータには大きな自由度があり、スキャフォールド材料の濃度と粘度を最大限に高めて、より理想的な構造成形効果を得ることができます。バイオインクには生きた細胞が含まれているため、3Dバイオプリンティングでは細胞の生物学的活動を維持するための印刷オプションが少なく、バイオインクの調製と印刷も過酷な環境を避ける必要があります。ハイドロゲルは天然の細胞外マトリックス（ECM）に非常に近いため、細胞はハイドロゲル内で生存することができ、現在、ハイドロゲルはバイオインクを調製するための最も重要な材料となっています[17、18]。 3次元バイオプリンティングの成形性能（構造に関係）と細胞活性（機能に関係）は、バイオインクの特性（粘度、強度など）に対して相反する要求を持っています。前者はバイオインクにより高い濃度、架橋密度などを求めますが、後者はその逆です。それぞれのハイドロゲルの欠陥により、複合バイオインクシステムが軟骨バイオプリンティングの主流になりました。現在、3Dバイオプリンティング技術はまだ開発段階にあります。適切なバイオインクの不足は、その開発を制限する重要な理由の1つです。より多くの代替バイオインクを開発することは、3Dバイオプリンティング技術の重要な研究方向です[19、20]。

2. 関節軟骨における3Dプリント技術の応用(I) 関節軟骨の解剖学的構造と機能骨軟骨組織の構造は繊細かつ複雑であり、解剖学的構造の面では、関節軟骨は軟骨下骨に接続されており、特定の骨軟骨単位の構造勾配と生物学的特性を持っています。骨軟骨界面は継続的に変化しており、軟骨組織は上から下まで異なる微視的解剖学的構造、機械的特性、生物学的特性を持っています[21]。顕微鏡解剖学では、関節軟骨は上から下に向かって、関節軟骨層、石灰化軟骨層、軟骨下骨層の3つの層に分けられます（図2）。関節軟骨層には、軟骨の表層、中間層、深層が含まれます。関節軟骨層は硝子軟骨層とも呼ばれ、硝子軟骨層と石灰化軟骨層の接合部は潮線と呼ばれ、軟骨深層部と石灰化軟骨層が絡み合い、柔らかい硝子軟骨組織と硬い石灰化軟骨を繋ぐ立体構造となっています。石灰化した軟骨層と軟骨下骨層との接合部はセメント線または結合線と呼ばれ、両側の構造を連結して固定します。

関節軟骨層は主に水、ECM（主にII型コラーゲン繊維）、軟骨細胞で構成されています。軟骨は表層から深層にかけて、コラーゲン繊維の直径や方向、各層の水分量、細胞の形態や種類などが徐々に変化します。軟骨表層ではコラーゲン繊維の直径が細く、密集して関節面と平行に並んでいます。軟骨中間層では、コラーゲン繊維の直径が太く、ランダムに並んでいます。軟骨深層では、コラーゲン繊維の直径がさらに太くなり、関節面と垂直になっています。軟骨深層からの太いコラーゲン繊維の一部は、潮線を貫通し、軟骨深層と石灰化した軟骨層をしっかりと接続します。軟骨の表層部の水分含有量が最も高く、深さが増すにつれて徐々に減少し、軟骨の深層部では水分含有量が最も低くなります。水分含有量は透過性と正の相関関係にあるため、軟骨の深層は透過性が最も低く、液体はほとんど組織を通過できません。そのため、この層に対する界面せん断力も最大になります。

石灰化軟骨層は、関節軟骨層と軟骨下骨層の間に位置する石灰化した骨組織の層であり、自然の境界層構造です。石灰化した軟骨層の軟骨細胞含有量と水分含有量がさらに減少し、組織の石灰化が起こりました。軟骨の圧縮係数と圧縮強度は表面から深部に向かって徐々に増加します。石灰化した軟骨層は形態的に緻密で、その硬度は関節軟骨層の10倍、軟骨下骨層の1/60です。機械特性の面では、石灰化軟骨層は、変動するせん断力の支持、力の緩衝、連結の役割を果たしており、運動中の関節への機械的衝撃を大幅に軽減し、関節軟骨のせん断力を圧縮応力に変換して軟骨下骨に伝達し、関節軟骨の粉砕や断裂の可能性を大幅に低減します。さらに、石灰化した軟骨層はバリアとして機能し、関節軟骨層と軟骨下骨層の間の物質の交換を妨げます[22]。

軟骨下骨層は、水（約 10%）、ヒアルロン酸、糖タンパク質（I 型および V 型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン）、およびミネラル成分で構成されています。軟骨下骨は、血管が発達したバイオミネラル結合組織です。多量のヒアルロン酸とI型コラーゲン繊維が、軟骨下骨に強い圧縮強度と硬度を与えています。軟骨と比較すると、軟骨下骨は圧縮係数が高く、弾性係数が低くなっています。

（ii）3Dプリント技術ソリューションの全体的な観点から見ると、関節軟骨の水分含有量は上から下に向かって徐々に減少し、プロテオグリカンと石灰化のレベルは徐々に増加します。関節軟骨は強い階層的発達をしているため、独特の生物学的特性と構造的複雑さを持っています[23]。 3Dプリンティング技術の層ごとの組み立て機能により、種子細胞、生理活性因子、生体材料を3次元空間に正確に配置して分布させることができます[24]。さらに、軟骨損傷は軟骨下骨の損傷を伴うことが多いため、3D プリント技術を使用して細胞勾配と配置構造を備えた軟骨スキャフォールドを製造できるため、二相性および多相性バイオニックスキャフォールドの構築に大きな利点があります。現在、一般的な軟骨スキャフォールドは、個別のバイオニックスキャフォールドと連続バイオニックスキャフォールドに分けられます。離散バイオニックスキャフォールドはさらに単相スキャフォールド、二相スキャフォールド、多相スキャフォールドに分類されます[25]。

単相スキャフォールドは、同じ構造、組成、機械的特性を持つ 1 つ以上の材料で作られていますが、その単一の多孔性と機械的特性では、関節軟骨の組織構造と機能の段階的な変化の要件を満たすことができません。二相性スキャフォールドは通常、軟骨相と骨相の2層構造を持ち、各層は組成、構造、機械的性質の点で軟骨組織構造に近いため、ある程度の軟骨骨統合修復を構築することができます[26]。 Swieszkowskiら[27]は、フィブリン/PCL相とPCL/PCL-リン酸三カルシウム相からなる二相構造を使用した。 2 つの構造体は、それぞれ軟骨と骨の再生のために、軟骨形成培地と骨形成培地に適切な数の細胞とともに播種されました。最後に、フィブリン接着剤を使用して 2 つの構造を 1 つの構造に統合し、軟骨の再生と新しい骨の形成が明確に観察されました。しかし、二相軟骨スキャフォールドには石灰化軟骨層が欠けており、ステント留置後にステント破損などの合併症が発生するため、軟骨骨統合修復においては三相および多相スキャフォールドの方が大きな利点があります。 3 相および多相スキャフォールドは、天然軟骨の層構造と機械的特性の変化をより適切にシミュレートできるため、理想的なバイオニック軟骨を構築できます。 Duら[28]はSLS技術を用いて、PCLとヒアルロン酸/PCLマイクロスフィアからなる多相骨軟骨スキャフォールドを作製した。このバイオニックススキャフォールドは、関節軟骨層から軟骨下骨層までの勾配組成変化をシミュレートする連続多層構造を有している。結果は、多相スキャフォールドが高度に相互接続された多孔性と望ましい機械的特性、および優れた生体適合性を備えていることを示しました。動物実験における生体内評価では、多相スキャフォールドが骨軟骨の修復をうまく誘導できることがさらに確認され、新たに形成された組織は関節軟骨や軟骨下骨を含む複数の組織タイプを示しました。個別の骨軟骨スキャフォールドと比較して、連続バイオニック軟骨スキャフォールドは、スキャフォールドの分離などの合併症の発生を大幅に低減します。連続バイオニック軟骨スキャフォールドは、各層の組成、構造、機械的特性を徐々にスムーズに移行し、統合構造を通じてスキャフォールドの安定性を高めることができます[29]。 Gaoら[30]は、二重水素結合モノマーであるN-アクリロイルグリシンアミド（NAGA）とN-トリス（ヒドロキシメチル）メチルアクリルアミド（THMMA）を共重合することにより、高強度の熱応答性超分子共重合体ハイドロゲルを合成した。 NAGA/THMMA 共重合体ハイドロゲル (PNT ハイドロゲル) は、温度に敏感な可逆的なゲル ↔ ゾル転移とせん断減粘挙動を示すため、3 次元バイオプリンティングによって、勾配成分 (上層に形質転換成長因子 β1 を充填し、下層に β-リン酸三カルシウムを結合) を備えた連続的な生体模倣軟骨スキャフォールドを作製できます。得られた勾配スキャフォールドは、高い忠実度と解像度を維持し、高度に相互接続された細孔と理想的な機械的特性、および優れた生体適合性を備えています。さらに、異なる層にトランスフォーミング成長因子β1とβ-リン酸三カルシウムをプリントしたバイオハイブリッド勾配ハイドロゲルを備えたこの足場は、体外でのヒト骨髄幹細胞の付着、拡散、軟骨形成、骨形成の分化を促進しました。

3. 耳介軟骨における3Dプリント技術の応用<br /> 軟骨は、弾性軟骨、線維軟骨、硝子軟骨の 3 つの主な形態で体内に存在します。これら 3 種類の軟骨はいずれも水分含有量が高く、軟骨細胞によって支持・維持されていますが、それぞれの ECM には II 型コラーゲンとグリコサミノグリカンが豊富に含まれており、それぞれに異なる機能があります。たとえば、外耳と喉頭蓋にある弾性軟骨には、組織に弾力性を与えるエラスチンを豊富に含む ECM があり、その主な機能は、構造と形状を維持しながら繰り返し屈曲する際にサポートを提供することです。耳介弾性軟骨では、部位によってECM含有量の分布が異なるため、部位ごとに機械的特性に違いが生じます[31]。耳軟骨のECMは主にプロテオグリカンと弾性繊維で構成されています。弾性繊維は耳介軟骨の中心部に密に分布していますが、周辺部にはまばらに分布しています。そのため、耳珠、耳輪、対耳珠、対耳輪、耳甲介、舟状骨（図3）などの耳介サブユニット構造はそれぞれ異なる機械的性質を持ち、その中でも耳輪の機械的強度は最も低く、対耳珠の機械的強度は最も高くなります。耳介軟骨は無血管で細胞濃度が低く、本質的に非増殖性であるため、機能的な組織ベースの自己治癒や再生が不可能である[32]。

先天性小耳症、耳の外傷、耳の手術、耳の炎症などの原因により、耳の軟骨にさまざまな程度の欠陥が生じることがあります。耳介軟骨欠損は、その生理機能や顔の外観に影響を与える可能性があり、重篤な場合には患者の精神的健康を危険にさらす可能性があります。そのため、耳介軟骨欠損の修復と再建は、患者の生活の質を向上させる上で非常に重要です。耳介軟骨の組織工学は、20年前にすでに成功していました。Caoら[33]は、不織布ポリグリコール酸メッシュ上に牛軟骨細胞を播種し、さらに溶媒鋳造法によってアルギン酸ナトリウム型を使用してポリ乳酸に埋め込み、人工耳を作成しました。この構造体は無胸腺マウスの皮下に移植され、12 週間後には新軟骨の肉眼的な組織学的外観を示しました。しかし、従来の技術で製造された耳軟骨スキャフォールドは、体内に移植されると崩壊し、それがこの軟骨スキャフォールドの致命的な弱点でもあります。天然の耳介軟骨のさまざまな解剖学的区分に適合する機械的特性を持ち、微細構造を持ち、体内で長期間安定できる耳軟骨スキャフォールドの開発は、組織工学耳軟骨研究と臨床変革において緊急に取り組む必要がある重要な課題です。

3D 印刷技術は、複雑な形状と複数の細胞タイプを持つ耳介軟骨スキャフォールドの製造に広く使用されています。 Xiaら[34]はゼラチンとヒアルロン酸をハイドロゲルに調製し、3Dプリントを使用して外部の3D形状と内部の細孔構造を正確に制御しました。次に、メタクリル酸無水物と光開始剤をハイドロゲルシステムに導入して、3Dプリント中に材料を光硬化可能にしました。最後に、凍結乾燥を使用して機械的特性をさらに改善し、分解時間を延長しました。フォトステレオリソグラフィー3Dプリントと凍結乾燥技術を統合することで、ゼラチンとヒアルロン酸を使用して人間の耳の形をしたスキャフォールドを作成することに成功しました。このスキャフォールドの形状の類似性は、元のデジタルモデルと比較して90％以上でした。最も重要なことは、軟骨細胞と組み合わせたスキャフォールドが、典型的なラクナ構造と軟骨特有の ECM を持つ成熟した軟骨を体外および自家ヤギモデルで正常に再生したことです。これにより、光立体造形 3D 印刷技術が、精密で複雑、高品質、パーソナライズされた天然スキャフォールドの製造に特に適していることが十分に実証されました。 Zopfら[35]は、レーザー焼結ベースの3Dプリント技術とPCLを耳介再建の原料として使用し、患者固有のスキャフォールドを作製しました。その結果、作製された耳介スキャフォールドは高い忠実度と微細な微多孔構造を持ち、軟骨再生をサポートすることが示されました。バイオプリンティング技術は、生体材料、種子細胞、生物学的因子を正確に堆積させ、足場内の材料と細胞を変化させることができます。近年、3次元バイオプリンティング技術の発達により、耳介軟骨スキャフォールドのさらなる進歩が促進されています。 Jangら[36]は、PCLと脂肪幹細胞と軟骨細胞の混合物を含む細胞充填アルギン酸ハイドロゲルをバイオインクとして使用し、3次元バイオプリンティング技術を使用して耳介フレームワークを正確に構築しました。耳介スキャフォールドは、高い多孔性、適切な孔サイズ、大幅に強化された機械的特性、および天然の耳介軟骨と同様の細胞勾配を備えていました。定量的および定性的な方法を使用して、in vitro 細胞の生存率、増殖、および分化を評価し、その結果はすべて、軟骨細胞と脂肪由来幹細胞が 3 次元スキャフォールド内で共培養された後に軟骨形成を促進することを示しました。さらに、ラットモデルを使用した生体内組織学的分析では、耳介スキャフォールドが生体内で良好に生存し、変位や炎症反応がなく、対応する領域に豊富なラクナ軟骨細胞と成熟した軟骨の広い領域を再生できることが示されました。これらの研究はすべて、3D 印刷技術の急速な発展により、天然の耳介軟骨のさまざまな解剖学的区分に適合した微細構造と機械的特性を備えた天然のバイオニック軟骨スキャフォールドの構築が可能になることを示しています。

4. 鼻軟骨における3Dプリント技術の応用<br /> 鼻は、支持構造、支持システム、被覆組織を含め、人間の顔の中で最も目立つ器官です。足場構造は骨と軟骨で構成されており、これらは結合組織と靭帯によって保持され、支えられています。表面は皮膚と軟組織で覆われています。先天性奇形、外傷、火傷、鼻の手術などはすべて鼻軟骨の欠損につながる可能性があり、患者の生活の質と精神的健康に大きな影響を与えます。鼻軟骨には、鼻中隔軟骨、翼軟骨、外側鼻軟骨（図4）が含まれており、鼻の2/3を占めています。鼻翼軟骨は鼻の下 1/3 の主要構成要素であり、その輪郭が鼻先の固有の特徴を決定します。鼻翼軟骨、外側鼻軟骨、鼻中隔軟骨の相互接続は、鼻先の支持、位置、輪郭に密接に関連しており、これらが一緒になって鼻の重要な美的次元を構成します。そのため、鼻の再建と鼻軟骨の再生は常に困難な課題となってきました。組織工学は過去20年間で驚異的な進歩を遂げてきましたが、ほとんどの研究の結果は不規則な形状の軟骨ビーズであり、精度が十分ではありません[37]。

3次元印刷技術は、患者のCT画像データまたは3次元のホログラフィックディスプレイに基づいて術前の鼻シミュレーションを実行します。さらに、従来の人工鼻インプラントは患者の体内に永久に残っているため、感染や免疫反応などの合併症につながる可能性があります。 3次元印刷された鼻インプラントは、選択された生分解性材料で作られており、合併症の発生率を減らし、鼻形成術に適したインプラントです[39]。適切な材料を選択してカスタマイズして、機能的にも審美的にも鼻を再構築することが、手術の成功を保証するための鍵です。現在、PCLは生体適合性があり、体内で安全に分解される可能性があるため、組織工学の分野で適切なポリマーになりました（3〜4年以上）。 PCLは、3次元印刷技術での足場またはインプラントとしての使用にも適しています[40]。 60°Cで溶け、溶解するために有毒な溶媒を必要とせず、層ごとに構造を構築するためにコンピューター制御パターンで押し出ることができます。これらのプロパティを使用すると、患者固有のコンポーネントを設計およびカスタマイズするために効果的に使用できます。 Park et al。 3DプリントされたPCL鼻ステントは、優れた生体適合性と形状保持を示し、鼻形成術と頭蓋顔面再構築の臨床的に生体適合性のある材料として使用できます。しかし、米国の食品医薬品局によって承認された生分解性ステント材料の一部には、シリコン鼻インプラントの柔軟性がないため、押し出し、感染、曝露のリスクをもたらします[42]。足場材料がin vivoで完全に生体適合性があるかどうかを評価することは厳密で長いプロセスであり、新しい生体材料が臨床使用の承認を得ることは困難です。ステントの構造を変更して柔軟性を向上させることは、新しいアイデアです。 Jung et al。他の細孔タイプと比較して、八面体の細孔構造は優れた柔軟性を持ち、鼻に置かれた後にその機械的安定性を維持できます。

鼻軟骨の3Dバイオプリントでは、インクジェット印刷と押し出しは、最も一般的に使用されている技術であり、高水分を備えた3次元のポリマーネットワークであり、構造的にECMを模倣しています。キャリア材料として、ヒドロゲルの特性は、生物学的な3D印刷の成功と品質を決定し、細胞の成長に適した微小環境を提供する必要があります。ただし、通常のヒドロゲルの架橋ネットワークは十分に均一ではなく、エネルギー散逸メカニズムを欠いているため、機械的特性が不十分であり、印刷可能性と生体適合性の両方を考慮した「適切な」バイオリンクになることが不可能になります。理想的な鼻軟骨ステントには、長期の構造安定性が必要です。ヒドロゲルが均一な3次元構造を維持できないことを補うために、ナノセルロース/アルギン酸ナトリウムヒドロゲルは、新しいタイプのバイオインクとして、ナノセルロースのせん断薄整数と、標準標準性と統合の積極性と統合を維持しています。 Mölleret al。鼻軟骨の足場は、マウスの60日間の移植後に良好な機械的安定性を示し、グリコサミノグリカン産生の徐々に増加し、鼻細胞増殖を徐々に増加させました。 Apelgren et al。[45]は、ヒト軟骨細胞およびヒト間葉系幹細胞と組み合わせてナノセルロースとアルギン酸塩を使用し、3次元の押出バイオプリンターを使用して構築物（5.0 mm×5.0 mm×1.2 mm）を使用しました。コンストラクトは、バイオプリンティングの直後に48個のヌードマウスの背面に皮下に移植され、30日後に形態学的および免疫組織化学検査がそれぞれ実施されました。軟骨細胞と幹細胞の混合物を含む構築物では、グリコサミノグリカンのレベルの増加と軟骨細胞によって合成されたII型コラーゲンが観察されました。この研究は、3Dバイオプリンティングが人間の軟骨を作るための有望な技術であることを示しています。さらに、鼻軟骨の多層的な不均一な構造を再現し、統合されたバイオセンシングシステムを使用してデュアルバイオインクノーズ構造を印刷しました。コンストラクトは、生体適合性条件下で臭気知覚を実現するための柔らかい硬いバイオリンクの複数の層で構成されており、軟骨細胞に搭載された3Dバイオプリント軟骨様構造には、電子嗅覚模倣バイオセンサーが搭載されています。メタクリロイルヒドロゲルとポリエチレングリコールジメタクリレートで構成される光クロスリンクヒドロゲルバイオインクは、強い機械的安定性と高い生体適合性を備えた3次元微小環境を形成し、バイオインクの機械的特性を調節することによりコンドロサイトの成長と分化をサポートします。したがって、さまざまな濃度のヒドロゲルで構成される2つの異なるバイオインクは、鼻腔軟骨におけるネイティブECMの機械的特性を模倣するために最適化でき、それにより鼻腔軟骨組織の形成を可能にします。

5。将来とOutlook <br /> 要約すると、骨軟骨組織の構造は非常に複雑であり、骨軟骨の欠陥の再生は、組織工学と形成外科において大きな課題のままです。現在、3次元の印刷技術を通じて、3次元モデルと軟骨（関節軟骨、メニスカス、椎間板、耳介、鼻）の足場が得られています。ただし、異方性軟骨の機能的構成要素を準備する際には、まだいくつかの課題があります。関節軟骨、メニスカス、および椎骨椎間板は、人体の負荷をかける部分に位置するため、軟骨足場には特定の機械的強度が必要です。着床後の吸収、変性、石灰化を防ぐために、耳介や鼻などの軟骨には、ある程度の弾力性だけでなく、ある程度の機械的強度も必要です[48]。組織の再生と修復中、組成の領域勾配（例：異なる細胞と生物活性分子）と構造（例えば、異なる細孔サイズ、微細構造、および材料の剛性）は、細胞の増殖、移動、および分化、ならびに構築物の機械的特性に影響します。したがって、さまざまな軟骨構造と生体模倣勾配を製造する方法を探ることが非常に重要です。従来の3D印刷技術は、体内の軟骨の構造的および生理学的特性をある程度シミュレートできますが、3DバイオプリンティングテクノロジーはCAD/CAMテクノロジーを使用して、外部形状、内部多孔性、および空間的および時間制御された堆積を介した活性細胞分布の正確な制御を実現し、したがって、生物軟骨の調製に適したソリューションを提供します。ただし、3Dバイオプリンティング技術はまだ成熟しておらず、解像度と精度をさらに改善する必要があります。現在、3D印刷技術と足場材料の改善、適切な生体力学的特性を備えた製造構造、および印刷を通じて高い細胞生存率と生体分子活動を確保し、バイオニック組織と臓器の構築を確保することに焦点を当てる必要があります。軟骨組織工学の開発動向は、天然材料と合成材料を組み合わせて、それぞれの利点に完全な遊びをすることです。多くの共重合体が成功裏に開発されており、軟骨再建に理想的な材料になると予想されています。適切な生体力学的特性、生体適合性、および表面形態を持つ足場を選択することは、軟骨の形成を促進するための鍵であり、科学者は努力を継続する必要があります。

現在、4次元印刷とスマートマテリアルの出現により、軟骨組織工学の新しいチャネルが開かれています。 4次元印刷は、スマートマテリアルの3次元印刷を具体的に指します。従来の3D印刷と比較して、4D印刷は「時間」の次元を追加します。これにより、印刷されたオブジェクト（形状、色、サイズなど）の物理的特性が外部刺激（温度、光、有機溶媒、湿度など）に応答することができます[49]。 4次元の印刷は、静的な印刷構造に動的な特性を与えて、複雑な幾何学的な形状を超えて材料の3次元印刷を拡張できます。近年、スマートマテリアルと新しい印刷方法の急速な発展により、4次元印刷の範囲が大幅に拡大されています[50、51]。スマートな生体材料は、細胞の挙動を調節し、組織の修復と再生のための好ましい微小環境を提供し、それによって軟骨の修復と再生を誘導します。このプロセスは、自然軟骨に近い材料の構造と機能を調整するために、または生理学的、生化学的、および物理的信号因子を積極的に提供するために、材料の構造と機能を調整することによって、受動的に反応することによって達成できます。細胞と生物活性因子を統合できる軟骨組織工学足場を構築するためのスマート生体材料の適用は、軟骨の修復と再生のための効果的かつ有望な戦略と考えられています。ただし、現在、臨床使用においてスマートな生体材料はほとんどありません。実際、臨床、新薬、診断、または機器のために、学術環境から最終的に科学の発見の5％のみが学術環境から変換されます。したがって、臨床的ニーズは、関節軟骨の修復と再生のためのスマート生体材料の開発の基礎でなければなりません。生体材料は、不活性な生体材料でさえ、細胞や組織との相互作用を改善し、高度な製造技術を通じて知性を獲得できます[52]。科学者は、インテリジェントな生物学的材料と高度な製造技術（3次元および4次元印刷技術）を組み合わせて、軟骨組織工学の進行を促進する必要があります。

参照：省略

軟骨組織工学における3Dプリントの応用

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