キトサンナノフィブリルを活用した創傷被覆材用全キトサンハイドロゲルの3Dプリント

出典: EngineeringForLife

3D 印刷技術で使用される直接インク書き込み技術は、バイオメディカルハイドロゲルの設計によく適用されます。最近、武漢理工大学のDuan Bo氏のチームは、直接インク書き込み技術を通じて創傷被覆材用の全キチンインクを調製する戦略を提案しました（図1）。印刷された足場は、均一なマイクロメートル規模の細孔構造とナノファイバー織りネットワークを示しました。キチンの優れた生体適合性と三次元空間骨格により、このスキャフォールドは創傷被覆材として優れた性能を発揮し、創傷における細胞増殖、コラーゲン沈着、血管新生を促進することができ、バイオメディカル用途における可能性を実証しました。

関連する研究成果は、「キチンナノフィブリル支援による創傷被覆材用全キチンハイドロゲルの3Dプリント」というタイトルで、2024年3月6日に「Carbohydrate Polymers」に掲載されました。

図1 キトサンベースの3Dプリントインクの設計
1. 3Dプリントキチン/MACNFインクの特性評価<br /> レオロジー試験は、直接インク書き込み (DIW) 複合インクの性能を特徴付ける効果的な方法です。まず、MACNF 添加がキトサンインクのレオロジー挙動と印刷性に与える影響を研究しました。せん断速度が増加すると、すべてのサンプルの粘度が急速に低下し、せん断減粘挙動が示されました（図2a）。図 2b は、振動応力の関数としての貯蔵弾性率 (G') と損失弾性率 (G'') を示しています。最終的に、3Dプリント用に5重量％、7.5重量％、10重量％のMACNFの導入量が選択されました。動的ステップひずみスイープもテストされ、3D 印刷プロセス全体がシミュレートされました (図 2c)。複合インクの固体状態と流動状態をそれぞれシミュレートするために、1% と 200% のひずみで 3 回のスキャンを連続的に実行し、各サイクルは 100 秒間続きました。

図2 15℃で試験したキトサン/MACNFインクのレオロジー挙動
2. 3Dプリントキチン/MACNFスキャフォールドのナノファイバー構造と機械的特性<br /> キトサン/5 wt% MACNF インクを例にとると、得られたスキャフォールドは明らかな崩壊や変形がなく、設計された形状を維持しました (図 3a、b)。スキャフォールドの表面と断面をSEMで注意深く観察した（図3c～f）。スキャフォールドの表面には、直径約 330 μm の均一な多糖類フィラメント構造が見られ、下層のフィラメントが上層のフィラメントを支え、重力を支えることができます。拡大写真では、足場の表面がキチンナノファイバーとMACNFを含む均一なナノファイバーネットワークであることが示されました（図3g）。圧縮試験では、MACNF の追加量がキチンハイドロゲルネットワークに大きな影響を与え、その結果、その機械的特性に影響を与えることが示されました (図 3h-i)。結論として、キトサン/5 wt% MACNF スキャフォールドは、印刷操作とアプリケーションに最適な充填剤の組み込みと機械的強度を示しました。

図3 SEMによる形態観察と機械的性質
3. 3D プリントされたキチン/MACNF ハイドロゲルの相互作用<br /> その後、研究者らは、XRD、FT-IR、XPS を使用して、3D プリントされたキチン/MACNF スキャフォールドハイドロゲル内の再生キチンと β-キチンナノファイバー間の相互作用を研究しました。 XRDはキチン/MACNFの凝集状態を示し（図4a-b）、特徴的なピークの変化は、MACNFの導入によりキチン分子鎖の自己組織化とキチン結晶の形成がある程度妨げられたことを示した。 FT-IR および XPS は、親水性カルボキシル基と豊富な酸素含有基を持つ MACNF が水素結合を介してキチン分子鎖と相互作用し、それによってキチンアルカリ溶液の溶液特性を制御し、その複合インクを印刷可能にできることを示しました (図 4c-g)。

図4 3Dプリントされたキチン/MACNFハイドロゲルの相互作用
4. 細胞適合性と生体内創傷治癒<br /> 続いて、マウス線維芽細胞（L929）に対する3Dプリントされた全キチンベースの足場の基本的な細胞毒性を、CCK-8および生死細胞染色によって評価しました。図 5 に示すように、L929 細胞は、フィルムおよびスキャフォールドグループとの共培養の 1、2、3 日後に健全な傾向を示しました。 CCK8 アッセイでは、細胞生存率は 90% 以上に達し、キトサン/5 wt% MACNF インクは L929 細胞に対してほとんど無毒であることが証明されています。

図 5 細胞適合性試験フィルムとスキャフォールドの効果をさらに評価するために、全層皮膚切開モデルで創傷治癒を促進する能力を研究しました。図6に示すように、回復時間が長くなるにつれて、マウスの傷は徐々に閉じ、大きさも減少しました。対照群と比較して、フィルムとスキャフォールドで治療した創傷は3日後に顕著な収縮を示し、キトサンハイドロゲルが創傷治癒を促進する効果があることを示しています。 HE 染色の結果 (図 7) は、顕微鏡下で、フィルムグループとスキャフォールドグループの未治癒領域がガーゼグループよりも小さく、どちらもある程度創傷治癒を促進したことを示しました。スキャフォールドハイドロゲルは、おそらく酸素交換と過剰な滲出液の蒸発を促進するマイクロメートル規模の細孔構造により、より効果的であり、創傷治癒に適した環境を提供します。マッソン染色により、キチンは創傷コラーゲン沈着を促進することで創傷治癒を加速できることが示され、スキャフォールド構造はフィルム構造よりも優れた効果を発揮しました（図8）。さらに、CD31免疫組織化学染色を使用して血管密度をさらに定量化し、血管新生を促進するハイドロゲルの役割を実証しました（図9）。

図6 創傷の変化図7 創傷部の表皮再生を伴う創傷のHE染色像図8 マッソン染色図9 CD31の免疫組織化学染色まとめると、本論文では、高解像度かつ形状忠実度の高い全キチンベースの3次元構造の構築に成功しました。 MACNF はインクのレオロジー特性を調整する増粘剤として機能します。 MACNF の表面にある親水性カルボキシル基と豊富な酸素含有基は、キチン溶液中に安定して分散することを可能にするだけでなく、キチン分子鎖と多数の水素結合相互作用を形成し、キチンの自己組織化と凝集プロセスに関与し、混合インクの印刷可能性を与えます。 3次元多孔質足場は適切な機械的強度を持ち、細胞の活動にほとんど影響を与えません。同じ配合のキャストフィルムとプリントされたスキャフォールドを傷口に適用すると、キチンは優れた生体適合性と生体活性を示し、細胞増殖、コラーゲン沈着、血管新生を促進し、最終的に傷の治癒を促進しました。スキャフォールドのミクロン規模の細孔構造により、スキャフォールドドレッシング下の創傷はフィルムドレッシング下の創傷よりも早く治癒しました。

出典: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122028

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