バイオアッセイマイクロ流体デバイスの製造のための二重硬化チオール-エンエポキシシステムの高解像度3Dプリント

出典: EngineeringForLife

高解像度の 3D プリンティングにより、マイクロスケールでのポリマー材料のカスタマイズされた処理が可能になり、光学、マイクロ流体工学、組織工学、生命科学における高度なアプリケーションが促進されます。しかし、閉じたマイクロ流体チャネルなどのマイクロメートル規模の密閉構造の 3D プリントは、残留硬化樹脂によってチャネル構造がブロックされることが多いため、依然として課題が残っています。非化学量論的チオール-オレフィンおよびチオール-オレフィン/エポキシ化学に基づくデュアルキュアシステムは、鋳造または射出成形されたマイクロ流体デバイスの接着剤なしの接合によく知られています。

ドイツのフライブルク大学の Dorothea Helmer 氏のグループは、カスタムマイクロ流体デバイスの製造のためのマイクロスケールのデュアルキュアチオール-オレフィン/エポキシ化学向けの初の高解像度ステレオリソグラフィー 3D 印刷方式を開発しました。最初の硬化ステップでは、高解像度の 3D プリントによってオープンなマイクロ流体構造が製造されました。その後、マイクロチャネルは熱誘導による接着剤を使わない接合によって密封され、最大 80 ミクロンの寸法を持つ、よく制御された構造が生成されました。結合前に、中間材料によってビオチン修飾などのカスタマイズされた表面修飾が可能になり、さまざまな生体分子の連続的な固定化が可能になります。密封されたチップ内の特定のパターンを使用した DNA バイオアッセイを実証しました。この研究は、広範囲の特定の生物学的アッセイ用にカスタマイズされたマイクロ流体デバイスの製造への道を開きます。関連研究は、2024年4月11日に国際的に有名な学術誌「Advanced Functional Materials」に「バイオアッセイ用マイクロ流体デバイスの製造のためのデュアル硬化チオール-エン/エポキシシステムの高解像度3Dプリント」という論文として掲載されました。

1. 革新的な研究内容<br /> この研究では、チャネルサイズが 80 μm のマイクロ流体デバイスを 2 段階で製造するための新しいデュアル硬化材料の高解像度 3D 印刷プロトコルを開発しました。開発された材料の二重硬化特性により、開いたマイクロチャネルを光重合によって高精度に印刷し、その後、2 番目の硬化ステップで中間材料を熱乾燥接着して密封することができます。チャネル幅 80 ミクロンのテスラミキサーなどの小さな機能の製造や、接着剤や粘着剤を使用しない便利な接合プロセスに加えて、デュアルキュア材料は、2 つの硬化ステップ間で表面のバイオ機能化も可能にします。この研究は、開いたチャネル表面のバイオパターン化と一本鎖 DNA の結合を利用して、相補的な DNA 鎖を特異的に検出できることを実証しています。開発されたデュアルキュア材料システムは、高解像度の構造化と便利なドライボンディングプロセス、および個別の生体機能化の能力を組み合わせ、幅広い特定のバイオアッセイ用のカスタマイズされたマイクロ流体デバイスの製造への道を開きます。

【デュアルキュアシステムの開発】

マイクロ流体構造の高解像度 3D プリントと接着剤を使用しない単一材料結合プロセスを組み合わせるには、2 つの独立した制御可能な重合ステップを備えた材料システムが必要です。チオールオレフィン樹脂は高解像度 3D 印刷でよく知られており、OSTE+ システムに基づく接着剤を使用しない接合方法はマイクロ流体デバイスの金型製造技術で人気があるため、高解像度 3D 印刷用に新しいチオールオレフィン/エポキシベースのデュアル硬化システムが開発されました。四官能性エチル p-トルエンジメルカプトプロピオネート (PETMP) を二官能性ビスフェノール A エトキシアクリレート (BPA-EDA) およびグリセロールジグリシジルエーテル (GDE) と組み合わせて使用し、2 つの異なる重合反応を介して 2 段階で重合できるモノマー混合物を設計しました (図 1a)。ジアクリレートはフリーラジカル重合によってチオールと反応しますが、GDE と PETMP は塩基触媒によるマイケル付加反応によって重合します。硬化ステップを制御し、2 つの重合反応を連続的に開始するために、それに応じて 2 つの開始剤が選択されました。ビスフェノール A エトキシアクリレートと PETMP のフリーラジカル重合はフリーラジカル光開始剤 Irgacure 819 によって開始され、GDE と PETMP のマイケル付加反応は熱開始剤 1,1-ジメチル-3-フェニル尿素 (PDU-250) によって開始されました。異なる活性化刺激に基づく 2 つの開始剤の組み合わせにより、材料を 2 つの連続したステップで硬化させることができます。最初のステップでは、PETMP と BPA-EDA の UV 開始重合によって中間材料が硬化されました。 2 番目の重合ステップでは、PETMP と GDE の熱開始マイケル付加反応によって最終材料が硬化されます (図 1b)。 UV開始重合に対する高い反応性と熱硬化工程での強力な接着性を実現するためには、第1硬化工程と第2硬化工程の良好なバランスが求められたため、樹脂組成表に従って官能基比4:2:2（チオール：アクリレート：エポキシ）が選択されました。 2 つの連続した硬化ステップを分析するために、それぞれの重合反応を FTIR で分析しました。図1cでは、チオール基の変換は、2570 cm−1のS─H伸縮バンドのシフトによって検出されました。このバンドのサイズは樹脂から中間体、そして最終材料へと徐々に減少していることがわかります。これは、2 つの硬化ステップでチオール基が変換されることを示しています。これは、図1dのGDEのC─O─C伸縮バンド（910 cm−1）とBPA-EDAのC═C振動バンド（810 cm−1）の分析によってさらに確認できます。

図1 デュアルキュアシステムの組成と硬化プロセスの特性 [デュアルキュア材料の高解像度3Dプリント]

前述の BPA-EDA の UV 開始重合と PETMP の高い反応性に加えて、調製された二重硬化樹脂は高い透明度という光学特性も備えていました。純粋なモノマー混合物は、可視範囲（400 nm 以上）の光を吸収しません。高い反応性と透明な光学特性の組み合わせにより、開発されたデュアルキュア樹脂は高解像度 3D プリント用の有望な材料システムとなります。 3D プリントに適した材料を得るために、PETMP、BPA-EDA、GDE に、光開始剤フェニルビス (2,4,6-トリメチルフェニル) ホスフィンオキシド (Irgacure 819)、阻害剤 4-メトキシフェノール (MEHQ)、吸収剤 2-ニトロジフェニルスルフィド (2-NPS) などの添加剤を加えました。デュアルキュアシステムは、5 µm レーザービームを備えた高精度 SLA プリンターである Dilase 3D を使用して、高解像度 3D 印刷機能をテストされました。 3D 印刷プロセスの解像度の限界を決定するために、細い線、中空構造、オーバーハングなど、3D 印刷の難しさがすべて含まれている 2 mm サイズの詳細な立方格子構造が選択されました。図 2a に示すように、サイズ 2 mm、線幅 50 µm の二重硬化材料の 3D プリント立方格子が正常に印刷されました。最小 50 µm のサイズの詳細な特徴を備えたこの 3D プリント構造は、開発された二重硬化材料が市販の SLA プリンターを使用して高解像度で処理できることを示しています。マイクロ流体デバイス製造のための 3D 印刷プロセスの解像度をテストするために、最小チャネルサイズが 80 µm のオープンマイクロ流体チップが 2 時間以内に印刷されました。図 2b に示すように、テスラミキサーチャネル構造を備えたオープンマイクロ流体デバイスが高解像度で印刷されました。図 2c および 2d の光学顕微鏡画像は、チャネル幅 80 µm のチャネル構造の明確な 3D 印刷効果を示しています。したがって、この研究で開発されたデュアルキュア材料は、詳細な 3D 特徴と個々のマイクロ流体構造の高解像度印刷に適していることが示されています。これにより、デュアルキュア材料の高解像度 3D プリントと接着剤不要の接合機能を組み合わせることで、マイクロ流体デバイスのカスタム製造が可能になります。

図2 高精度SLAプリンターDilase 3Dと5ミクロンビームを使用したデュアルキュアリング材料の高解像度3Dプリント[マイクロ流体チップの単一材料接合とシーリング]
最終的なマイクロ流体デバイスを得るには、3D プリントされた開いたチャネルを閉じて密閉する必要があります。図 3a の概略図に示すように、3D プリントされたオブジェクトには、チオール基とエポキシ基の官能基が保持されています。 2 番目の重合ステップでは、チオールとエポキシ基の熱開始マイケル付加反応を利用し、接着剤や追加の表面処理なしで 3D プリントされた中間体を結合することができます。密封するには、開いたマイクロ流体部分と平らな上部部分を揃え、50 g の圧力を加えて、130 °C で 20 分間加熱します。この熱処理後、最終的なマイクロ流体デバイスはさまざまなマイクロ流体アプリケーションで使用できるようになります。図 3b、c は、シール処理の前後の幅 100 µm の直線マイクロチャネルの断面を示しています。開いたマイクロ流体部分の底部は高速印刷のために 40 µm のビームで印刷され、チャネル構造は高精度と滑らかな表面品質のために 5 µm のビームで印刷されたため、図 3b では開いたチャネルの底部にインターフェースも示されています。さらに、図 3b の断面図では、印刷されたチャネル壁がチャネル底部に対して完全に垂直ではなく、20° の傾斜で印刷されていることがわかります。チャネル幅が当初の設計よりも上部で広くなったため、樹脂は鋭いエッジに硬化せず、層ごとにチャネル幅をわずかに広げました。 2 つの断面を比較すると、2 つの部品がしっかりと接合されており、シーリングプロセスがチャネル構造に影響を与えていないことがわかります。密封性と混合品質をテストするために、メインチャネルサイズが 200 µm の 3D プリントおよび密封されたマイクロ流体テスラミキサーを、チップコネクタを介してチューブとポンプに接続しました。図 3d では、マイクロ流体ミキサー内で青色と黄色に染色した水の混合がテストされています。このチップは、2 つの液体を漏れなく混合し、緑色の液体を形成します。混合挙動をより詳細に分析するために、黒色水と無色水の混合を光学顕微鏡で調べました。図 3e、f に示すように、2 つの液体は並流でチャネルに入ります。 4 つのテスラミキサーユニットを通過した後、均質な灰色の混合物が得られました。標準的な薄型マイクロ流体システムの製造に加えて、この研究のアプローチでは 3D デバイスの構築も可能になります。 3D スパイラルチャネルを備えた印刷されたシリンダーは、二重硬化材料の層を巻き付けて熱乾燥接着することで密封されました。

図3 3Dプリントされたオープンマイクロチャネルのシールとマイクロ流体アプリケーションのテスト [デュアルキュア材料の物理的特性]

マイクロ流体デバイスの高精度な設計と簡単な製造に加えて、材料の物理的特性も非常に重要です。特に、機械的特性、耐水性、およびさまざまな溶媒に対する耐薬品性は、マイクロ流体デバイス用材料の重要な特性であり、それらの用途の範囲を定義します。本研究で開発された二重硬化材料の機械的特性、耐水性、耐薬品性について以下で分析します。機械試験では、サンプルごとに 5 回の測定を実行し、平均値と標準偏差を計算しました。各サンプルの曲線の例を図 4a に示します。図 4a に示すように、第 2 段階の硬化により、中間材料の機械的特性は最終材料のレベルまで大幅に向上します。中間材料はヤング率が 1.44 MPa と柔らかい挙動を示しましたが、最終材料の剛性は 6.90 MPa とほぼ 5 倍に増加しました。 2回目の重合により破断応力も5倍に増加しましたが、破断ひずみは19%のままでした。マイクロチップに使用される標準材料である PDMS Sylgard 184 (ヤング率 1.28 MPa、引張強度 6.7 MPa) と比較すると、この研究の二重硬化材料は剛性が 5 倍に増加しています。しかし、提案されたデュアルキュアシステムの引張強度は 1.23 MPa であり、Sylgard 184 の引張強度よりも大幅に低くなります。全体として、本研究で検討した二重硬化材料は、マイクロチップ用途の標準材料に匹敵し、2 回目の硬化ステップ後に適切な機械的特性を備えています。熱処理下での接合工程の強度と中間材の修復能力を試験するために、切断、再組み立て、熱修復後の中間材の試験片に対して機械試験を実施した。図 4a に示すように、修復された材料は最終材料と同じ剛性 (6.87 MPa) を示しており、共有結合の強さを示しています。しかし、修復された材料の破壊ひずみと引張強度は、19% から 3.4% に、1.23 MPa から 0.31 MPa に減少しました。市販のデュアルキュア材料 OSTEMER 322 は、当社が開発したデュアルキュア材料の熱接着強度 (0.31 MPa) と比較して、1.0 MPa の接着強度の向上を示しました。しかし、PS-PS（0.38 MPa）、PMMA-PMMA（0.19 MPa）、PET-PET（0.25 MPa）などの一般的な熱可塑性材料や、アクリレート/エポキシベースのデュアルキュア接着剤（0.26 MPa）の熱接着強度は、本研究で開発された材料の強度と同等です。したがって、バインダーレスドライボンディング用に提案されたデュアルキュアシステムは、適切な接着強度を備えたマイクロ流体デバイスを製造するための簡単な方法を提供します。機械的特性に加えて、デュアルキュア材料の濡れ性と耐薬品性もテストされました。 2 回目の重合ステップでは、水接触角が 74° から 101° に増加しました。これは、残留官能基が消費され、材料表面特性が疎水性になったためです (図 4b)。この疎水性挙動は、水、エタノール、アセトンによる膨潤試験でも確認されました（図4c）。この材料は、24時間以内に水とエタノールに対して高い耐薬品性を示し、膨潤率はそれぞれ1.9％と2.9％でしたが、アセトンに対する膨潤率は44％に達し、アセトンに対する耐薬品性が低いことがわかりました。したがって、開発されたデュアルキュア材料は、強力な共有結合能力を持ち、適切な密封性を提供し、水とエタノールに対する高い耐薬品性を備えており、ほとんどの生物医学および生化学の合成または分析プロセスに適しています。

図4 二重硬化材料の中間状態、最終状態、および治癒状態の材料特性 [DNAバイオアッセイのための二重硬化材料のバイオパターニング]

マイクロ流体デバイスの段階的な製造プロセスにより、オープンチャネルを 3D プリントし、制御された第 2 の重合ステップでシステムを密封することで、密封前に中間材料によって特定の表面機能化が可能になります。生化学用途における標準溶剤である水とエタノールに対する高い耐薬品性がすでに実証されているように、デュアルキュア材料とその製造プロセスはバイオアッセイとの適合性についてテストされています。図 5a-c の概略図に示すように、中間材料は、以前に報告したフォトリソグラフィープロセスによってカスタマイズされたパターンで生体機能化され、最終的なマイクロ流体デバイスに密封されました。表面を生体機能化するために、ビオチン-5-フルオレセイン（B5F）を光照射によって材料表面に共有結合させました（図5d、e）。ビオチン機能化表面はその後、2つの異なるバイオアッセイに使用されました。1つ目はストレプトアビジンの検出（図5e、f）、2つ目は相補DNAの特異的検出（図5g～i）です。ビオチン-ストレプトアビジンアッセイでは、ビオチン機能化表面をシトクロム 3 標識ストレプトアビジン (STV-Cy3) で洗浄します。分析溶液を除去し、表面を緩衝液で洗浄した後、材料表面のビオチンパターンへの STV-Cy3 の結合を蛍光顕微鏡で検出しました。図 5j に示すように、蛍光標識されたストレプトアビジンの結合により、ビオチンのパターンがはっきりと見えるようになります。 DNA アッセイでは、ビオチン機能化がバイオパターン形成プロセスとして再び使用されました。これは、ビオチン - ストレプトアビジンシステムが、ストレプトアビジン機能を持つさまざまな分子を結合するために使用できる多目的システムであるためです。次のステップでは、ビオチン機能化表面（図 5e）をストレプトアビジン溶液（図 5g）で処理しました。デバイス表面への DNA の統合は、ビオチン標識一本鎖 DNA 溶液で洗浄することによって達成されました (図 5h)。この DNA 機能化デバイスは、相補的な DNA 配列を特異的に検出する準備が整います。 DNA アッセイでは、DNA 機能化表面を Atto550 標識相補一本鎖 DNA 溶液で処理し、緩衝液で洗浄し、蛍光顕微鏡で分析しました。

図 5. バイオ分析試験用の二重硬化材料のバイオパターニング。
2. まとめと展望

この研究では、高解像度の 3D プリントマイクロ流体デバイス向けの新しいデュアルキュア材料の開発について説明します。開発された材料の制御可能な二重硬化特性により、マイクロ流体デバイスを段階的に製造することが可能になります。最初に、高解像度の 3D 印刷によってカスタマイズされたオープンチャネルが作成され、次に、単一材料の接着剤を使用しない接合プロセスを使用して 2 番目のステップで密封されます。樹脂の組成と印刷パラメータを最適化することで、特徴サイズが 50 ミクロンの 3D 格子テスト構造と、サイズが 80 ミクロンのマイクロ流体チャネルを 3D 印刷することに成功しました。材料の機械的特性を分析したところ、2 回目の硬化により材料のヤング率が大幅に増加し、疎水性がわずかに増加したことがわかりました。さらに、デュアルキュア材料の耐薬品性を分析したところ、水とエタノールに対して優れた耐性があることが示されました。高い設計柔軟性と容易な製造プロセスに加えて、デュアルキュア材料は、3D プリントと接着の 2 つのステップの間でマイクロ流体デバイスの表面の機能化も可能にします。中間材料の高解像度ビオチン機能化により、ストレプトアビジンでタグ付けされたさまざまな生体分子を特異的に固定化できます。例えば、シアノバクテリア 3 標識ストレプトアビジンの検出と相補 DNA 配列の特異的認識が蛍光顕微鏡によって実証されました。密封されたチャネル内のバイオパターンの検出に成功したことで、ビオチン機能化とヒートシールプロセスの互換性、およびマイクロ流体チップ内の光学検出に適した材料の光学特性が実証されました。提案された材料システムは、特定の機能を備えたカスタマイズされたチップを、市販のプリンターで 2 時間以内に高解像度のマイクロ流体で製造する道を開きます。

出典: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202401516

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