膝関節の半月板は、大腿骨遠位部と脛骨近位部顆の間の三日月形の結合組織であり、主に機械的な力を吸収する役割を果たします。半月板損傷後は通常、半月板切除または半月板移植置換療法が行われます。半月板切除術では大腿骨と脛骨が露出しやすくなり、その結果、過度の摩耗が起こり、変形性関節症にかかりやすくなります。変形性関節症は、心不全、脊髄損傷、呼吸器疾患、脳卒中の最も一般的な慢性的な原因の 1 つです。一般的に、半月板、腱骨接合部、脊椎の椎間板、顎関節の欠損など、線維軟骨組織に関連するほとんどすべての傷害や疾患は、自然に治癒しません。
他のほとんどの複雑な組織の再生と同様に、半月板の再生における障害は、複数の組織や細胞の再生を達成することが難しいことです。半月板は、外側の I 型コラーゲンが豊富なマトリックス内の線維芽細胞と、内側の硫酸化グリコサミノグリカン (GAG) と II 型コラーゲンが豊富なマトリックス内の軟骨細胞を含む、さまざまな結合組織細胞で構成されています。中央部分には線維軟骨細胞が含まれており、I 型コラーゲンと II 型コラーゲンの両方を分泌します。これまでの研究では、単一の細胞を使用して複雑な細胞集団を含む半月板組織の再生を達成することは困難であることが示されています。さらに、外側だけでなく、半月板の内側と中間部分への血液供給不足も、半月板の修復を困難にします。
本研究では、著者らは半月板の不均一な構造を模倣する3Dプリント技術を設計し、半月板の外側と内側の2つの特定の領域に2つの異なる成長因子をゆっくりと放出し、2つの領域に異なる細胞外マトリックスの分泌を誘導して、半月板の再生と修復を促進しました。
結果と考察：
パート1
rhCTGFおよびrhTGFβ3因子はMSCの線維軟骨分化を誘導するために使用された。
この計画では、MSC 細胞を rhCTGF と rhTGFβ3 で異なる順序で処理し、次に細胞の線維芽細胞分化を研究し、主に COL-I、COL-II、アグリカン (AGC) の発現を検出します。結果は、rhCTGF が II 型コラーゲンと AGC の発現を促進し、rhTGFβ3 が I 型コラーゲンの発現を促進することを示しました。
図1 (A) MSCをrhCTGFおよびrhTGFβ3で順番に処理した後のproCOL-IおよびproCOL-IIαの免疫蛍光分析（C→T（rhCTGF処理2週間、続いてrhTGFβ3処理2週間）、T→C（rhTGFβ3処理2週間、続いてrhCTGF処理2週間）、C + T（rhCTGFとTGFβ3の同時処理4週間）、C4（rhCTGF処理のみ4週間）およびT4（rhTGFβ3処理のみ4週間））。
(B)～(D)は、ステップ(A)で処理した後のMSCにおけるCOL-I、COL-II、およびAGCの相対的なmRNA発現解析です。
パート2
ヒト半月板スキャフォールドの 3D プリントと in vitro 特性評価
3Dプリンティング技術を用いてポリカプロラクトン（PCL）材料を印刷することでヒト半月板形状のフレームが得られ、その後、ポリ乳酸-グリコール酸（PLGA）マイクロスフィアを徐放性材料として使用し、3Dプリントされた半月板フレームの外側と内側にそれぞれrhCTGFとrhTGFβ3を巻き付けて、最終的にヒト半月板スキャフォールドが得られました。さらに、2つの因子をロードしない（空のPLGAマイクロスフィアをロードした）3Dプリント半月板スキャフォールドもコントロールグループとして印刷されました。試験管内持続放出実験では、両因子とも良好な持続放出挙動を示すことが示されました。ヒト滑膜MSCを6週間のin vitro培養後、スキャフォールドの外側にI型コラーゲンが大量に発現し、内側にII型コラーゲンが大量に発現していることが判明しました。これはラットの半月板構造と一致しています。 1:1混合線維芽細胞と軟骨細胞を6週間インビトロ培養した後、アルシアンブルー染色（プロテオグリカンを観察）、シリウスレッド染色（I型およびIII型コラーゲンを観察）、免疫蛍光染色（I型およびII型コラーゲンを観察）のすべてにおいて、ヒト半月板スキャフォールドの外側にはI型コラーゲンの発現が多く、内側にはII型コラーゲンとプロテオグリカンの発現が多いことが示されました。両者の接続部にはより明らかな遷移ゾーン界面があり、これはヒト半月板の構造的特徴と一致していました。
図2 (A) 3Dプリントされた人間の半月板フレームワーク構造。
(B) rhCTGFとrhTGFβ3をそれぞれカプセル化したPLGAマイクロスフェア（μS）を3Dプリントされた半月板スキャフォールドのフレームワークに充填し、PCL繊維の表面に接着した。
(C) CTGF（緑、40kD）とTGFβ3（赤、10kD）が蛍光標識されており、2つの因子がそれぞれヒト半月板スキャフォールドの外側領域と内側領域にロードされていることが示されています。
(D) ヒト半月板スキャフォールドにおけるhCTGFおよびrhTGFβ3のin vitro持続放出データ。
(E) ヒト滑膜MSCをスキャフォールド上で6週間培養した後、徐放性rhCTGFとrhTGFβ3により、それぞれ特定の領域で細胞がI型コラーゲンとII型コラーゲンを発現するように誘導され、その構造はラットの半月板の構造に類似していました。
(F) 線維芽細胞と軟骨細胞の 1:1 混合集団を、ヒト半月板スキャフォールド上に in vitro で播種しました。培養 6 週間後に、アルシアン ブルー染色、シリウスレッド染色、免疫蛍光染色の結果が得られました。
パート3
3Dプリントされた羊の半月板スキャフォールドと生体内テスト
羊の死体にある天然半月板の3次元モデルデータを基に、PCL半月板形状のスキャフォールドを3Dプリントし、内側と外側にそれぞれrhCTGFとrhTGFβ3を充填しました。 After obtaining the sheep meniscus scaffold, mechanical analysis was performed and it was found that the scaffold had better dynamic modulus (E*), storage modulus (E') and loss modulus (E") than the natural sheep meniscus. It was surgically implanted into the medial meniscus of the sheep. After being removed 12 weeks later, digital photos and HE staining results showed that the articular cartilage on the femoral and tibial condyles was almost intact (Figure 3). After the regenerated meniscus was removed, HE staining, Sirius red staining and Alcian blue staining were performed (Figure 4). The results showed that compared with the 3D printed meniscus scaffold without load factors, the 3D printed meniscus scaffold with two factors distributed in a specific area had significantly closer collagen fiber and cartilage matrix expression to the natural meniscus after 12 weeks of repair. Specifically, the experimental group had more type I collagen expression on the outside and more type II collagen and proteoglycan expression on the inside, which was consistent with the structural characteristics of the natural meniscus of the sheep.
図 3 (A) 羊半月板の 3 次元スキャン、再構築、3D プリントにより羊半月板スキャフォールドを取得。
(B) 3Dプリントされた羊の半月板スキャフォールドと天然の半月板の動的弾性率 (E*)、貯蔵弾性率 (E')、損失弾性率 (E") の比較。
(C) ステント外縁と天然半月板の 2-0 縫合糸の縫合後の引き抜き強度。
(D) スキャフォールドと自然半月板の摩擦係数。
(E) 羊の内側半月板の外科的移植。
(F) 手術後12週間に撮影したデジタル写真とHE染色結果。
図4（A）天然ヒツジ半月板におけるコラーゲン繊維と軟骨マトリックスの分布。
(B および C) 生体内移植後 12 週間における放出可能な rhCTGF および rhTGFβ3 について、実験群 (B) と対照群 (C) の特定領域の組織学的染色を比較した。 組織切片はH&E、アルシアンブルー（AB）、シリウスレッド（PR）で染色されました。
(D) 再生半月板の外側、中央、内側のHE染色結果。
(E) 生体内移植後12週間における対照群と実験群の組織学的染色の低倍率画像。
移植後12週間で再生した羊の半月板（対照群および実験群）と天然半月板を外側、中間、内側の3つの部分に分け、応力緩和試験機械試験を順番に実施して、各群の各領域の瞬間弾性率（Ei）、緩和弾性率（Er）、粘性係数（μ）の機械データを取得しました。同時に、3 つのグループに対して引張機械試験を実施し、ヤング率、極限強度、極限ひずみの機械データを取得しました。結果は、関連する機械的試験結果において、実験群の機械的特性が対照群よりも優れており、天然の半月板組織の機械的特性に近いことを示しました。
図5 移植後12週間における再生羊半月板（対照群および実験群）と天然半月板の各領域（外側、中間、内側）の瞬間弾性率（Ei）、緩和弾性率（Er）、粘性係数（μ）。
(B) 3つのグループの引張ヤング率、極限強度、極限ひずみデータ。
要約:
1. 著者らは、天然の半月板は内側と外側の 2 つの構造に分かれており、この 2 つの部分のコラーゲン繊維、軟骨マトリックス成分、細胞の種類が異なると提唱しています。外側部分には I 型コラーゲン マトリックスと線維芽細胞が豊富に含まれており、内側部分にはプロテオグリカン、II 型コラーゲン マトリックス、軟骨細胞が豊富に含まれています。複雑なマトリックス成分と細胞構成は、半月板再生において難しい問題となっています。
2. 著者らは、MSC を in vitro で線維軟骨細胞に分化するように誘導し、その結果、rhCTGF は II 型コラーゲンの発現を促進し、rhTGFβ3 は I 型コラーゲンの発現を促進することが示されました。これがこの研究の理論的根拠です。
3. PLGAマイクロスフィアの持続放出技術と3Dプリント技術を組み合わせることで、異なる領域で2つの成長因子rhCTGFとrhTGFβ3を持続的に放出できる3Dプリントヒト半月板スキャフォールドが作製されました。また、このスキャフォールドは、外側でI型コラーゲンを、内側でII型コラーゲンとプロテオグリカンを細胞に発現させることがin vitroで実証されました。
4. 羊の半月板欠損モデルを構築し、3D プリントされた羊の半月板スキャフォールドを体内に移植します。 12 週間の培養後、ブランクのコントロール グループと比較して、特定の領域に分布する 2 つの因子を搭載した 3D プリント半月板スキャフォールドでは、修復後 12 週間でコラーゲン繊維と軟骨マトリックスの発現が自然な半月板に大幅に近づくことがわかりました。同時に、機械実験では、実験群のスキャフォールド移植の結果が優れていることが示され、半月板再生におけるスキャフォールドの応用可能性が示されました。
出典：科学研究相互援助チーム
参考文献:
Lee CH, Rodeo SA, Fortier LA, et al. タンパク質放出ポリマー足場はヒツジの膝半月板再生のための内因性細胞の線維軟骨細胞分化を誘導する[J]。Science Translational Medicine、2014、6(266):266ra171。（IF=16.796）
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