Nature Communications: 治癒困難な骨欠損の治療のための「3D バイオプリンティング +」戦略

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

難治性骨欠損（一定サイズを超える分節骨や骨粗鬆症性骨欠損など）は、骨内細胞の移動が制限されていたり、再生能力が弱いために自然治癒できず、その修復と機能再建は臨床上困難な問題となっています。生体材料と健康な細胞から作られた組織工学による骨代替物は、この問題を解決する新たな希望をもたらします。過去 20 年間で骨組織工学は飛躍的な進歩を遂げてきましたが、時間のかかる体外培養や細胞分布の正確な制御が不可能なことなどの問題はまだ解決されていません。押し出しベースの 3D バイオプリンティング技術は、細胞の正確な送達を実現し、材料と細胞の複合体をカスタマイズする効果的な方法を提供します。しかし、押し出し印刷プロセス中の細胞活動と足場の機械的安定性の難しさのバランスを取り、3D印刷技術と足場のサイズの精度を確保しながら、ロードされた細胞の高い生存率を維持することは、非常に困難です。

この問題を解決するために、中国科学院深圳先端技術研究所の阮長順氏のチームは、心臓の鼓動と血液の送り出しにヒントを得て、機械支援による新たな「バイオ3Dプリント+」戦略を提案した。まず、3Dプリントを組み合わせて、機械的応答性を備えた大規模で複雑な構造の中空繊維ハイドロゲルスキャフォールドを構築し、スキャフォールドの機械的応答性能を利用して、迅速で均一、正確でフレンドリーな細胞負荷を実現した。この戦略に基づいて得られた細胞充填スキャフォールドは、治癒が困難な骨欠損の修復と機能再建を効果的に促進しました。この戦略は、現在の押し出しベースの 3D バイオプリンティングプロセスにおける細胞活動と足場の機械的安定性のバランスをどのように取るかという問題を効果的に解決し、組織工学や再生医療などの分野に新しいアイデアを提供します。

関連する研究結果は、2024年4月26日に「困難な骨欠損修復のための機械的支援によるポストバイオプリンティング戦略」というタイトルでNature Communicationsに掲載されました。

1. 革新的な研究内容

本研究では、機械的刺激に可逆的に反応できる心臓にヒントを得た構造を持つ、高度に調整可能な中空繊維ハイドロゲル足場（HHS）を作製し、迅速で均一、正確で優しい負荷を実現しました。メタクリル化ゼラチン、ナノクレイ、N-アクリロイルグリシンアミドの混合インクを使用して、コアサポート材料を使用せずにワンステップの共軸印刷により、高忠実度の大型 HHS を構築しました。HHS は均一で完全であり、構造的に高度に調整可能な中空繊維を備えています。 HHS は優れた弾力性、迅速な形状回復、優れた耐疲労性を備えています。最大 80% の圧縮歪みでも迅速に回復し、10,000 回の圧縮サイクル後も構造が損なわれずに維持されます。さらに、その機械的応答挙動は圧縮ひずみとサイクル数によって制御できます。 HHS の機械的応答動作により、機械的刺激下での細胞の迅速 (4 秒)、正確、かつ分割された負荷を実現できます。静的条件と比較すると、HHS によってロードされるセルの数は 13 倍増加しました。この研究では、細胞を充填したHHSがラットの分節骨欠損および骨粗鬆症性骨欠損に及ぼす修復効果をさらに検証しました。結果は、細胞を充填した HHS が満足のいく治癒効果を示したことを示しました。一般的に、この研究は、細胞と生体材料の機能的な組み立てのための新しい、多用途で効率的なアプローチを提供し、再生医療のための組織工学と細胞療法を促進します。

【HHSの大規模複合構造物の建設】
この研究は同軸 3D プリントをベースとしており、コアサポート材料を使用せずに、大規模で複雑な形状の組織工学骨を 1 つのステップで直接構築します (図 1a、b)。印刷性に優れ、十分な機械的強度と生体適合性を備えたメタクリル化ゼラチン/リチウムケイ酸ナノクレイ/N-アクリロイルグリシンアミド複合材料を印刷インクとして使用しました。共軸針の外殻を通して押し出し、紫外線で硬化させた後、高忠実度で安定した形状のHHSが得られました。HHSは水中に浮遊させることができ、中空のチャネルがはっきりと見えています（図1c）。これは、中空構造のHHSを構築できる可能性を示しています。

図1 「3Dバイオプリンティング+」戦略と組織工学骨スキャフォールド構築の概略図
【中空構造と調整可能なグリッドを備えたHHS】

HHS のメソ構造とグリッドは高度に制御可能です。図 2a に示すように、研究者らは HHS 中空繊維の内径と外径 (それぞれ d と D)、同じ層にある 2 つの中空管間の最短距離 (L)、中空繊維の空間体積 (V1)、およびグリッド内の体積 (V2) を定義しました。図 2b、c、d に示すように、滑らかで均一な中空チューブ、完全な中空構造、高忠実度のメッシュが明確に観察され、L、D、D は幅広い調整が可能です。 LxはGeSiM Roboticsソフトウェアを通じて簡単に調整でき、中空管のDy（y範囲は0.4〜0.8mm）、dz（z範囲は0〜0.6mm）、壁厚Dy-dz（0〜0.4mm）は、同軸ノズルの内外寸法を調整することで調整でき、それによってHHSの性能を調節できるため、研究チームが印刷したHHSは優れた設計性を備えていることがわかります。

図2 HHS調整可能な中空構造とグリッド
【HHSの圧縮性、弾性、形状回復性、耐疲労性】

HHS は、優れた圧縮性と弾力性、迅速な形状回復、優れた耐疲労性を備えています。研究者らはさらに圧縮実験と周期的圧縮実験を実施し、中空繊維の内径 d が HHS の機械的挙動に及ぼす影響を総合的に研究しました。 d が増加すると、HH の圧縮強度と弾性が向上し、80% のひずみ後でも HH はそのままの状態を維持し、初期状態に回復することができます (図 3a)。さらに、研究者らは蛍光液体を使用して、HHSの圧縮回復速度を視覚的に実証しました。圧縮と形態回復の1サイクルはわずか4秒で、1秒以内に急速に回復することができ、これは心臓の収縮と弛緩に似ています。次に、HHS の再現性と疲労耐性を 40% のひずみで検証しました (図 3c、d)。中空構造のない足場は 102 サイクル後に深刻な損傷を受けましたが、HHS は 104 サイクル後も構造的完全性を維持しました。結果は、HHS が優れた抗疲労性能を持っていることを示しています。

図3 HHSの機械的性質
【HHSの機械的応答性】

HHS は機械的反応行動を持ち、外部からの機械的刺激に素早く反応することができます。機械的応答性をさらに研究するため、研究者らは機械的刺激の有無にかかわらず HHS を水中に浸しました。図 4a および b に示すように、機械的刺激がない場合、その吸水能力は GLN ハイドロゲルの膨張や HHS の中空構造ではなく、グリッドに依存します (図 4c)。さらに、HHS の吸水率はひずみとサイクル数の増加とともに大幅に増加しましたが、V1 のない HHS の吸水率は一定のままでした (図 4d–f)。さらに、L と d も HHS の吸水に大きな影響を与えます。さらに、20% および 40% のひずみでは、サイクル数の増加に伴って水分の吸収が大幅に増加しました (図 4f)。動的機械的刺激下では、V1 によって HHS が優れた機械的応答能力を発揮できること、またその機械的応答能力は d、ひずみ、サイクル数の増加とともに増加することがわかります。

図4 HHSの機械的応答性
[HHS のセルを迅速かつ均等に、正確に、そしてフレンドリーにロードする能力]

本研究では、HHS の迅速な圧縮回復能力と優れた機械的応答性に基づいて、機械的に支援された「バイオ 3D 印刷 +」戦略を開発し、高速、均一、正確、かつフレンドリーな細胞負荷を実現しました。図5a、bに示すように、4秒以内にHHSを負荷した細胞の数は、静的条件と比較して約13倍に大幅に増加しており、V1機械的応答経路の活性と有効性を示しています。 3日間の培養後、HHS 内の細胞は均一に分布し、著しく増殖しました。一方、HHS 内の負荷セルの数は、圧縮ひずみ (図 5c) またはサイクル数 (図 5d) の増加とともに増加し、提案された戦略が制御可能であることを示しています。従来の組織工学では、複数の種類の細胞をスキャフォールドに導入することはできません。この研究では、V1 と V2 間の異なる機械的応答性を利用して、複数の細胞に正確に区画化された負荷をかけました。図 5ei に示すように、研究者らはさらに単純な V2 機械的応答経路を開発しました。直接細胞接種と比較すると、細胞は HHS の V2 (表面 - 中央 - 底部) 全体に均等に分布し (図 5eii、eiii)、HHS の V2 内の数は約 200% 増加しました (図 5eiv)。図5fに示すように、V1+V2機械的応答の連続プロセスを通じて、V1とV2で2種類の細胞分割負荷が達成されました。さらに、HHS は内皮細胞の表現型を維持し、幹細胞の骨形成分化を促進することができます (5g、h)。

図5 HHS機械応答ロードセル
【細胞を充填したHHSが治癒困難な骨欠損を修復】

この研究では、細胞を充填した HHS がラットの重大な分節骨欠損および骨粗鬆症性骨欠損を修復する能力をさらに評価しました。ラットの大型分節骨欠損部の修復では（図6）、細胞負荷HHSは、術後6週間でブランク群およびHHS群と比較して周囲の新生血管形成を有意に促進し、術後12週間で大腿骨欠損部の近位端と遠位端にブリッジを形成し、細胞負荷HHSの新生骨量はHHS群の2.5倍でした。ラットの骨粗鬆症性骨欠損修復に関しては、手術後4週および8週の細胞負荷HHS群も、ブランク群およびHHS群よりも優れた骨再生能力を示しました（図7）。研究により、治癒が難しい骨欠損に対して、細胞と組み合わせた HHS は骨欠損の修復と機能的再建に満足のいく治療効果を示すことが示されています。

図6 細胞を充填したHHSによるラットの大型分節骨欠損の修復に関する研究図7 細胞を充填したHHSによる骨粗鬆症ラットの骨欠損の修復に関する研究
2. まとめと展望<br /> 要約すると、この研究では、シンプルなワンステップの同軸印刷法によって、コアサポート材料を使用せずに中空繊維構造の高さを調整できる一連の大規模で複雑な HHS を 3D 印刷することに成功しました。得られた HHS は、優れた弾性、迅速な形状回復、および傑出した耐疲労性を示し、制御可能な機械的応答挙動を示します。 HHS の機械的応答特性を利用すると、迅速、均一、正確、かつ優しい細胞負荷を実現できます。得られた細胞搭載HHSは、治癒困難な骨欠損の修復と機能再建を効果的に促進し、骨再生分野における組織工学の応用を促進しました。本研究で提案された新しい機械的支援「バイオ3Dプリンティング+」戦略は、現在の押し出しベースのバイオ3Dプリンティングプロセスにおける細胞活動と足場の機械的安定性のバランスの問題を効果的に解決し、細胞と生体材料の機能的組み立てのための新しい普遍的で効率的なアプローチを提供し、再生医療における組織工学と細胞療法の使用を促進します。

出典: https://doi.org/10.1038/s41467-024-48023-8

Nature Communications: 治癒困難な骨欠損の治療のための「3D バイオプリンティング +」戦略

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