細胞球の成長と放出のための 3D 印刷バイオインクとしての二重架橋アルギン酸ベースの熱応答性ハイドロゲル

出典: GK グリーンキーバイオテック

パトラス大学化学工学部のジョージ・パスパラキス教授のチームは、Carbohydrate Polymers誌に「細胞球の成長と放出のための3Dプリントバイオインクとしての二重架橋注入可能なアルギン酸ベースのグラフトコポリマー熱応答性ハイドロゲル」と題する論文を発表しました。この研究では、著者の研究チームは、ポリ(n-イソプロピルアクリルアミド-co-n-tert-ブチルアクリルアミド)P(NIPAM-co-NtBAM)側鎖を持つアルギン酸ナトリウムグラフトコポリマーに基づく二重架橋ネットワークを開発し、それをせん断減粘性ソフトゲルバイオリンクとして研究しました。提案されたバイオインクは、穏やかな 3D 印刷条件下で任意の形状に形成できます。研究者らは、開発されたバイオインクがバイオプリンティングインクとしてさらに使用できることを実証し、3D環境におけるヒト骨膜由来細胞（hPDC）の3Dスフェロイドの成長と形成を促進する能力を示しました。結論として、バイオリンカーはポリマーネットワークの架橋を熱的に逆転させる能力を持っているため、細胞スフェロイドの迅速な回復にも使用でき、3Dバイオファブリケーション用の細胞スフェロイド形成のテンプレートとして使用できる可能性があります。

概要 - 二重架橋注入型熱応答性ハイドロゲルとは何ですか?

二重架橋された注射可能な熱応答性ハイドロゲルは、物理的架橋（イオン架橋など）と化学的架橋（熱応答性疎水性相互作用など）の 2 つの架橋方法を組み合わせた高度な生体材料であり、特定の温度で可逆的な変化を起こす特性を与えます。このハイドロゲルは注射できるように設計されており、体内または体外で温度を変えることで物理的状態を調節できるため、3Dバイオプリンティング、薬物送達、組織工学などの分野で幅広い応用が期待できます。

理由 - 細胞球の成長と放出のための 3D 印刷バイオインクとして、二重架橋注入型熱応答性ハイドロゲルを使用する理由は何ですか?

二重架橋機構により、材料の機械的強度と安定性が向上します。射出成形設計により、3D プリンター機器を使用して精密に成形することが容易になります。熱応答特性により、材料は温度変化に応じて相転移を起こし、細胞球の形成と放出を促進します。この素材は細胞に優しく、細胞の成長と分化をサポートします。適切な物理化学的環境は細胞球状体の形成を促進します。熱応答性によりスフェロイドの回収が簡単になります
方法 - 研究チームは、細胞球の成長と放出のための 3D 印刷バイオインクとして、アルギン酸ナトリウムグラフト共重合体をベースにした二重架橋注入可能な熱応答性ハイドロゲルを提案しました。

ここでは、疎水性共モノマー N-tert-ブチルアクリルアミド [NaALG-gP(NIPAM-co-NtBAM)] を強化したポリ (N-イソプロピルアクリルアミド) の熱応答性側鎖をグラフトしたアルギン酸ナトリウムベースの二重架橋ポリマーゲル化剤について報告します。臨界温度以上に加熱すると、P(NIPAM-co-NtBAM)側鎖の疎水性結合により二次架橋が誘発され、強化されたハイドロゲルが形成されます（図1）。加熱すると、アルギン酸側鎖の最初のイオン架橋ネットワークが、二重架橋ネットワークの機械的特性を増幅します。

図1 細胞スフェロイドの形成と回復のための注入可能な二重架橋アルギン酸ベースのハイドロゲルバイオインクと、3Dバイオプリンティングへの応用を示す模式図
NaALG-gP は、さまざまな濃度の Ca2+ カチオンが存在する水系で研究されました。特に、熱サイクルと冷却サイクルの後、ひずみ振幅を 0.1% に保ちながら、傾斜速度 1 °C/分、周波数 6.28 rad/s で線形粘弾性領域における振動せん断実験が実行されました。 Ca2+ の効果をより詳細に見ると、図 1 はアルギン酸/PNIPAM ベースのシステムのレオロジー挙動を示しており、6 つの配合すべてに対するレオロジーせん断振動データも示されています。異なる f 比を持つ 3 つの特徴的なハイドロゲルの光学観察は、図 1a の写真で見ることができます。

異なる架橋モード間に相互作用があるかどうかを調べるために、20～37℃の間の過剰G′（ΔG′20～37）が図1fにプロットされ、熱による増粘効果がネットワーク架橋に寄与していることが示されています。 ΔG′ は、イオン結合により弾性が生じる臨界値 f = 0.03 より上および下において、二価カチオン濃度とともに直線的に増加します。 f>0.03Δの場合、G′はfとともに大幅に増加し、イオン結合と疎水性会合メカニズムの相乗効果が明らかになります。

図 1 アルギン酸/PNIPAM ベースシステムのレオロジー挙動グラフト共重合体デュアルゲルのレオロジー挙動に影響を与える可能性のあるもう 1 つの調整可能な要因は、熱応答性ステッカーのモノマー組成です。図 2 は、NtBAM 含有量が異なる 2 つのアルギン酸ナトリウム/カルシウムゲルの熱応答を比較しています。 NtBAM の疎水性を 6 mol% から 14 mol% に増加させることの主な効果は、Tg が約 10 °C シフトすることです。両方のゲル化剤の Tg 未満では、ネットワークが同じ f のイオン架橋によって形成されている場合、2 つのシステムの貯蔵弾性率は等しくなります。

図 2 異なる NtBAM 含有量を持つ 2 つのアルギン酸ナトリウム/カルシウムゲル化剤の熱応答。比較のために、追加のイオン架橋のないシステムでのゲル形成も研究されました。カルシウムを含まない系の弾性率 G′、G′′ を角周波数 (ω) の関数として調べたところ、20°C (すなわち Tg 以下) では疎水性相互作用もイオン性相互作用も存在しない液体のような挙動を示しました。 37 °C では、NaALG-gP(NIPAMx-co-NtBAMy) システムは、2 つの相互作用 (疎水性およびイオン性) が共存して過度に大きな架橋密度を与える NaALG-gP(NIPAMx-co-NtBAMy)/Ca2+ システムと比較して、PNIPAM ベースのグラフト鎖の疎水性のためだけに、より弱いゲル状形成を示しました。

図 3 NaALG-gP(NIPAM86-co-NtBAM14) (Ca2+ フリー) ハイドロゲルはゾル-ゲル相転移を示します。研究した全温度範囲において、イオン架橋ネットワークの G′ は大幅に高くなっています。 Tg ではより弾性のあるハイドロゲルが形成されました。 2 つの架橋間で生じる相乗効果をさらに評価するために、NaALG/Ca2+ ベースのハイドロゲルのレオロジー挙動も調査し (グラフト鎖なし)、同じ F およびポリマー濃度のグラフト共重合体のレオロジー挙動と比較しました。これらの結果は、図 3b のデータで観察された相乗効果を正当化します。

図 4 NaALG-gP(NIPAM86-co-NtBAM14) (Ca2+ フリー) ハイドロゲルはゾル-ゲル相転移を示します。ポリマーベースの熱応答性ハイドロゲルの重要な特徴は、注入中にせん断によってネットワークが破壊された後 (その場でゲル化)、生理学的温度で回復することです。したがって、ハイドロゲル/Ca2+サンプルは、線形粘弾性領域（ひずみ振幅γ = 50、ここでG′′>G′）よりも十分に高い20°C（すなわち、注入温度）でひずみスイープで前処理され、続いて、ひずみ振幅0.1%（線形粘弾性範囲内）で37°Cで時間スイープ実験が行われました。図 4a は、37 °C に温度平衡した後、貯蔵弾性率が損失弾性率によって支配される場合の、瞬間的なゲル回復を示しています。図 4b は、さまざまなせん断速度と温度におけるその後のせん断粘度のステップを示しています。
要約すると、著者らは、細胞を宿す生体模倣マトリックスとして 37 °C で強力なゲルを形成し、球状体の形成と成長を促進することを目指しました。理想的なバイオインクは、わずかな粘性により細胞と容易に混合でき、室温での印刷プロセス中に細胞を保護できる柔らかいゲルを構成する必要があります (図 5)。

図 5 Ca2+ の有無による 5 wt% NaALG-gP (NIPAM86-co-NtBAM14) ハイドロゲルの粘度変化。著者らは、制御された薬物放出分析、浸食駆動型拡散率、細胞のカプセル化と放出など、バイオメディカル用途にとって重要なパラメータであるハイドロゲルの浸食も評価しました。図 5c に示すように、単一架橋ハイドロゲルの侵食速度は二重架橋ハイドロゲルの侵食速度よりも大幅に速いです。熱応答性ハイドロゲルの膨潤率も研究されました（図5d）。ゲルを37℃のPBSおよびPBS/Ca2+溶媒に浸した。 37 °C では、PBS 中のカルシウムを含まない熱応答性材料の水分吸収が時間の経過とともに大幅に増加し、最も高い膨潤能力 (9000%) を示しました。

図6 バイオマテリアルインクの拡散率上記のハイドロゲルを、最初に37℃のプリンターの加熱ベッド上で、次に室温のベッド上で再度3Dプリントし、バイオマテリアルインクの拡散率を評価しました。広がり率は、図 6a に示すように、線幅を針の内径で割ることによって定義されます。注入戦略を通じて、異なる温度でのサンプルの粘度は、球状体の潜在的な積荷として重要な役割を果たします。粘度が低いゲルでは、注入中に細胞を移動させるために必要なせん断応力が少なく、20 °C または 37 °C でのポリマーマトリックスの独特な侵食プロファイルは、その後の細胞/スフェロイド 3D 印刷プロセス中に異なる細胞スフェロイドの放出プロファイルを示す可能性があります。
この研究では、イオン架橋機構と熱架橋機構の相互作用により、得られた材料の注入性/印刷性を損なうことなく、非常に穏やかな条件下でゲルの機能的および機械的特性（弾性率、耐侵食性、膨潤制御）が大幅に向上しました。

図 7 ハイドロゲル内の細胞生存率と成長最後に、著者らが開発したハイドロゲルが細胞生存率と細胞形成特性に与える影響を評価するために、著者らは一連の 3D バイオプリンティング細胞培養実験を実施しました。図 7a の光学顕微鏡画像では、1 日目には細胞がハイドロゲル全体に均等に分散していたのに対し、後の時点では 3D スフェロイドの形成が観察されたことが示されています。培養時間を最大 15 日間延長してもヒト由来の単一細胞によって形成されたスフェロイドのさらなる成長が見られなかった細胞株とは異なり、HEK293T 細胞株は、制御されない細胞分裂 (不死化細胞株) により同じ播種密度でより大きなスフェロイドを形成したため、著者らは 7 日目にスフェロイドの観察を終了しました。

これらの観察に基づいて、著者らは 3D 細胞培養における細胞の生存率と増殖を研究するために一連のアッセイを実施しました。 EdU染色によって示されるように、2つの増殖培地で細胞が異なるリズムで増殖することがわかりました（図7b）。 7 日目のサンプルの EdU 染色によって示された増殖能力は、研究で使用された 2 つの培地間で増殖速度能力に差があることを示しました。

図 8 細胞培養培地の代謝物分析このシステムがハイドロゲル内で細胞の成長をサポートできることをさらに実証するために、グルコース、乳酸、乳酸脱水素酵素 (LDH) などの代謝物の追加代謝分析を実施しました。図 8a に見られるように、識別されたすべてのサンプルでグルコース消費が発生し、対応するコントロールベースラインと比較して、さまざまな時点でグルコース消費が徐々に減少しました。

図 9 スフェロイド形態解析最後に、共焦点顕微鏡で得られた画像を DAPI と収集したファロイジンで染色し、スフェロイド形態解析を行いました。 3 日目に 3D 再構成した画像 (図 9a) を使用して、両方の培地で培養したハイドロゲル内のスフェロイドの空間分布を調べました。著者らは、F-アクチンを可視化することで球状体の境界を調査することを目的とし、同時に核の染色により球状体の細胞密度に関する情報も得た。著者らは、球状体形成の速度論を明らかにするために、3日目と7日目の球状体の測定直径を比較した（図9c）。 2 つのグループ間では、スフェロイドあたりの細胞数に統計的な差は見られませんでしたが (図 9e)、スフェロイドあたりの細胞数の不均一な分布が観察され、3D 培養環境におけるこれらの細胞の特徴的な不均一性がさらに検証されました。著者らはまた、極めて低い開始細胞密度を使用した場合でも、hPDC 細胞は依然として球状体を形成し、最大 7 日間生存する能力があることを実証しました。

結論: この論文では、アルギン酸ナトリウムグラフト共重合体をベースにした二重架橋 3D 印刷バイオインクの開発に焦点を当てています。アルギン酸フレームワークはポリマーネットワーク内での原位置での球状体の急速な形成を促進し、可逆的なゲル分解により、生存能力とコンパクト性を損なうことなく球状体を容易に回収することができました。最後に、穏やかな二重架橋メカニズムが動的機械特性を大幅に増幅し、機能的な生細胞集団の 3D 印刷に適した堅牢なポリマーネットワークにつながることがわかりました。私たちが提案するアプローチにより、温和な条件下で自己修復性とせん断減粘性を備えたポリマーネットワークを開発し、球状体の形成を促進できます。これにより、薬物スクリーニング、微小組織形成、3D in vitro モデリング、注射可能な治療薬など、さまざまな生物医学的用途で球状体カプセル剤としてこれらの生体材料を利用することが可能になります。

オリジナルリンク: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.120790

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