卵白がバイオインクになる？ 3Dプリントされた足場の生物学の改善

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

3 次元マイクロ押し出しバイオプリンティングは、空間的に定義された細胞分布を持つ階層構造の機能的な組織代替物の製造に大きな関心を集めています。かなりの進歩があったにもかかわらず、好ましい細胞反応と高い形状忠実度を兼ね備えた適切なバイオインクが不足しているなど、いくつかの重大な制限が残っています。

この制限に対処するために、ドレスデン工科大学のマイケル・ゲリンスキー氏のチームは、卵白（EW）で機能化したアルギン酸メチルセルロース（AlgMC）混合物の新しいバイオインクを革新的に設計しました。バイオプリントされた AlgMC+EW 構造は優れた形状忠実度を示し、カプセル化されたヒト間葉系幹細胞 (MSC) は、印刷後の生存率が高く、マトリックス内での接着と拡散も示しました。

関連する研究結果は、2023年2月3日に「卵白は、体積骨構造の3Dバイオプリンティング用のアルギン酸メチルセルロースバイオインクの生物学的特性を改善する」というタイトルでBiofabricationに掲載されました。

1. 異なる EW 濃度の低粘度 Alg ハイドロゲルにおける細胞応答 EW が細胞応答に及ぼす影響を調べるために、Alg 含有量を 3% (w/v) で一定にし、EW の割合を 0～100% の範囲で変化させた 6 種類の Alg ハイドロゲル組成物を調製しました。これらのバイオインクをベースにした細胞を含んだ円盤状の構造を押し出し堆積法で作製した（図1A）。培養1日目および7日目に、作製した細胞を含んだディスクの細胞適合性を生死アッセイで評価したところ（図1B）、各グループの細胞生存率は80％以上に達しました。したがって、EW をサポートするバイオインクは、押し出しベースの足場における MSC の生存率を促進する可能性があります。

図 1 3D プリントされたスキャフォールドと細胞生存率さらに、細胞密度は 1 日目と比較して減少しました (図 2A)。対照的に、E40-H60 グループでは MSC の絡み合った細胞骨格ネットワークが見られ、7 日間の培養後、E60-H40、E80-H20、E100-H20 グループでも細胞の接着と拡散が観察されました (図 2A)。つまり、EW で修飾された Alg バイオインクでは細胞が接着して拡散する可能性がありますが、有意な効果を得るには EW の濃度が 40% を超える必要があります。異なるスキャフォールドにおける細胞形態をさらに分析するために、培養7日後の細胞面積（細胞骨格染色の被覆面積）を定量的に測定しました（図2C）。その結果、EWを含むAlgインクはゲル内でのMSCの付着と拡散を促進でき、EWの量は40％未満であってはならないことが示されました。

図2 異なるEW比の押し出しAlgバイオインクにおける細胞生存率
2. EW 対応アルギン酸インクにおける MSC の生存率と接着性を調査すると同時に、MC の印刷性を向上させる EW を含む Alg インク (3%、w/v) の粘度が低いため、バイオプリント構造の開放多孔性に必須である多孔質グリッド状構造を形成するのに十分な形状忠実度を持つラインを 3D プリントすることができません。そのため、粘度と印刷性を高めるために Alg インクを MC と混合しました。これまでの細胞反応結果に基づいて、著者らはバイオポリマー Alg および MC の溶媒として E40-H60 および E60-H40 混合物 (つまり、EW 濃度 40% および 60%) を選択しました。関連する調製プロセスの概略図を図 3A に示します。ここでは、MSC をさまざまなインクに追加して、バイオインクと押し出し構造を調製します。

その後、細胞の生存率と形態を評価することにより、調製されたバイオインクにおける細胞反応の予備評価を実施しました。異なる濃度のEWとMCを含む押し出しディスク構造におけるMSCの生存率は、培養1日目と21日目に生死染色によって評価されました（図3B）。これらの結果から、MC を添加した場合、MC を含まない Alg ゲルと比較して細胞生存率が低下することが結論付けられました。 21 日間の培養後、すべてのグループで高い細胞生存率を維持できました。さらに、著者らは、細胞が構造内に付着して広がる可能性があることを発見しました (図 3B)。

図3 調製プロセスの概略図と細胞染色の代表的な蛍光顕微鏡画像細胞形態をさらに調べるために、培養1日目と21日目に細胞核とアクチン細胞骨格を蛍光染色し、撮影した画像を図4Aに示します。 60% EW グループは 40% EW グループよりも細胞の成長をよりうまくサポートし、細胞骨格の形態学的分析から、60% EW のグループはより優れた細胞接着と拡散を示しました。これはおそらく、これらの材料がより多くの接着部位と MSC に適した微小環境を提供したためと考えられます。細胞骨格染色後の顕微鏡写真に基づく細胞面積の定量分析では、60％EW群の細胞面積が40％EW群の細胞面積よりも大きいことが示された（図4C）。これらの結果は、60% EW の AlgMC バイオインクがバイオプリント構造において良好な細胞応答を示し、40% EW グループよりも優れた性能を発揮することを予備的に示しています。そのため、さらなる実験には 60% EW の AlgMC バイオインクが使用されました。

図4 MCとEWの比率が異なるバイオプリントAlg-MC-EW構造におけるMSCの細胞生存率
3. レオロジー特性 レオロジー特性は、ペースト状の生体材料の印刷性に決定的な影響を与える物理化学的パラメータです。開発されたインクの生物学的特性評価の結果に基づいて、インク組成物60-40（3-3）、60-40（3-6）、および60-40（3-9）のレオロジー特性をせん断傾斜試験およびせん断回復試験によって調査しました。 MC濃度を3%から9%に増加させることにより、0～100 s−1のせん断速度範囲で粘度が着実に増加し、すべてのグループで優れたせん断減粘挙動も示されました（図5A）。

一般的に、粘度が高いほど印刷の忠実度が高くなります。つまり、MC はハイドロゲルインクの粘度を高め、印刷の忠実度を向上させる補助剤として使用できます。結果は、開発されたインクが、交互に高低のせん断応力にさらされても弾性を回復する能力を持っていることを示しており、これは、インクが優れた形状保持特性を持ち、押し出しベースの印刷に適していることを意味します。さらに、オートクレーブ処理は調製したインクのレオロジー特性に悪影響を与えないことがわかり、アルギン酸塩とメチルセルロースを滅菌するための便利で効果的な方法であると考えられます。

図5 細胞懸濁液添加前後のインクのレオロジー特性
4. 卵白インクをベースとした複雑な 3D 構造の印刷性と構築特性 EW 支持バイオインクの押し出し性と安定した鎖を形成する能力は、ディスク状の足場を手作業で製造することによって評価されました。すべてのグループで良好な押し出し性が観察され、連続フィラメントを形成することができました（特定の粘度と押し出し挙動に応じて印刷圧力を調整します）。著者らは、レオロジー測定、フィラメントの崩壊（図6A）、および融合試験（図6B）の結果から、60-40（3-9）およびHBSS（3-9）インクは、3Dスキャフォールド製造において優れた印刷性と形状忠実度を示したと結論付けました。著者らはさらに、この新しい EW インクの自立能力を調べるために、難しい幾何学的特徴を含む複雑な体積構造の 3D 印刷を検討しました (図 6C)。すべての構造は、細胞が酸素や栄養素、代謝副産物を輸送するために重要な、開いた相互接続されたマクロポアを備え、形状と設計特性を維持しています。さらに、より複雑な構造とより困難な特徴（解剖学的形状、動物モデル、湾曲した織り交ぜられた多孔質構造の印刷など）も得られました（図 6D-H）。

図6 複雑な3D構造の印刷可能性と構造的特徴
5. 3DプリントされたAlgMC+EWスキャフォールドの細胞適合性 3D プリントされた AlgMC+EW インクで播種された hTERT-MSC の細胞生存率と接着挙動を評価するために、スキャフォールドを 1、4、7 日間培養し、生細胞/死細胞生存率を染色しました。スキャフォールド上の生細胞/死細胞を染色した蛍光画像と、細胞生存率および接着率の定量分析を図 7A-C に示します。 AlgMC + EWスキャフォールドの細胞密度はAlgMC群よりも高く（図7C）、AlgMC + EWスキャフォールドがMSCにとってより魅力的な環境を提供していることを示しています。対照的に、AlgMC + EWスキャフォールド上の細胞は著しく広がり、スキャフォールド表面に付着しました（図7A）。これにより、接着率も増加しました（図7C）。一方、ほぼすべての生細胞は適切な接着レベルを示し、足場の表面に広がり、伸びて隣接する細胞とつながり、糸状仮足のような伸展を示しました。さらに、計算された細胞接着率はさらに増加し、AlgMC群よりも有意に高かった（図7C）。

図7 無細胞AlgMC+EWスキャフォールドの作製と3Dプリントスキャフォールドの細胞適合性の評価

6. AlgMC+EW スキャフォールドにおけるヒト一次前骨芽細胞 (hOB) の骨形成分化 EW の骨形成分化に対する効果をさらに調査するために、変形性関節症患者のヒト大腿骨頭から分離した hOB を AlgMC + EW バイオインクに懸濁して hOB 搭載スキャフォールドを作製しました。一方、hOB を搭載したプレーンな AlgMC スキャフォールドを対照群としてバイオプリントしました (図 8A)。 AlgMC + EW インクの hOB のほとんどは、細胞密度が高く細長い形態を示しましたが、AlgMC スキャフォールドでは球形が依然として観察されました。さらに、スキャフォールド内の細胞核と細胞骨格の蛍光染色を行い、1日目、21日目、28日目の細胞形態をさらに観察しました。 AlgMC スキャフォールド内の細胞は小さく丸いままでしたが、わずかに細長い細胞形態を示した細胞はわずかでした。同様の結果は 28 日目まで維持されました。さらに、図 8D は、AlgMC + EW スキャフォールド内の細胞数が AlgMC 内の細胞数よりも有意に多かったことを示しています。これらの結果は、EWがhOB細胞の接着、拡散、移動、増殖を促進する機能を持つことを示している（図8）。この効果は骨形成培地での培養後にさらに増強されましたが、これはおそらく、細胞接着のためのインテグリン結合モチーフを提供する EW ベースのバイオインク内のタンパク質の存在によるものと考えられます。

図 8 3D スキャフォールドの製造プロセスと AlgMC および AlgMC + EW スキャフォールドの細胞特性評価要約すると、アルギン酸、メチルセルロース、卵白 (EW) で構成される最適化された配合の新しいバイオインクが開発され、優れた印刷性と高い形状忠実度、優れた細胞応答が組み合わされています。 EW 添加が骨形成分化に及ぼす影響を調査するために、ヒト一次前骨芽細胞 (hOB) を AlgMC+EW バイオインクでバイオプリントしました。 hOB の高い生存率 (93.7 ± 0.2 %) と培養時間の経過に伴う接着、およびバイオインク内での増殖と移動が示されました。いくつかの骨形成マーカー（IBSP、BGLAP）の遺伝子発現も、EW スキャフォールドがない場合と比較して促進されました。

ソース：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb8dc

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