3Dプリントされた複合足場は骨の形成と血管新生を促進する

出典: EngineeringForLife

骨欠損治療用のスキャフォールドは、血管新生をサポートし、骨形成を促進して、バイオメディカル機器への応用を容易にする必要があります。骨欠損治療および骨再生のための現在の生体材料スキャフォールドは、材料の複雑さを最小限に抑えながら、組織の統合、血管新生、および骨形成を強化するために、緊急に改善する必要があります。しかし、従来の足場は、効果的な栄養供給と老廃物の除去に十分なチャネル構造を提供する上で限界に直面することが多く、チャネルを含む生体材料の足場が潜在的な解決策となっています。これを基に、オーストラリアのモナッシュ大学の Neil R. Cameron 氏と Mikaël M. Martino 氏は、3D プリントされた水溶性ポリビニルアルコール (PVA) 犠牲鋳型を使用して、マイクロチャネルとマルチスケール多孔性を備えた重合高内部相エマルジョン (polyHIPE) スキャフォールドを設計する新しい方法を提案しました。 2 つの犠牲金型バリアント (250 μm と 500 μm) が熱溶解積層法を使用して生成され、HIPE で充填され、その後溶解されてマイクロチャネルを含むポリ HIPE スキャフォールドが生成されました。試験管内評価では、細胞浸潤、増殖、骨形成分化が大幅に促進されることが明らかになり、マイクロチャネルが細胞の挙動に好ましい影響を与えることが強調されました。骨形成因子 BMP-2 は、より高い充填効率と制御された放出を実現し、マイクロチャネルは成長因子の放出を促進します。マウスの臨界サイズの頭蓋冠欠損モデルの評価により、BMP-2 を含むマイクロチャネルスキャフォールドで血管新生と骨形成が強化されることが明らかになりました。要約すると、この研究は、ポリHIPEスキャフォールドにマルチスケールの多孔性を作り出す実行可能な方法を紹介するだけでなく、細胞浸潤、制御された成長因子の放出、および生体内パフォーマンスを向上させる能力も強調しています。上記の結果は、ポリHIPEスキャフォールドが骨組織工学および再生医療における優れた応用の見通しを有しており、このタイプの生体材料スキャフォールドの変革を促進することが期待されることを示しています。

関連研究内容は、2024年7月30日に「Acta Biomaterialia」に「3Dプリントネガティブモールドから製造された生体活性ポリマー複合スキャフォールドが骨形成と血管新生を可能にする」というタイトルで掲載されました。

図1 マイクロチャネルを含む多孔質DPEHAスキャフォールドの作製

PVAフィラメントの3Dプリントにより、水平面内で0度と90度で観察される層状の垂直柱が生成され、柱の直径はそれぞれ250μmと500μmでした（図1A）。高内部相エマルジョン（HIPE）UV重合、ネガティブモールド溶解、およびスキャフォールド脱水後、結果として得られたマイクロチャネルは、垂直軸と水平軸の両方でスキャフォールド全体に相互接続されました（図1B）。 SEM 画像では、両方のスキャフォールドのチャネル表面に小さな開口部があり、マイクロチャネルの直径は 250 μm (250μC) と 500 μm (500μC) であることが示されました。

図2 マルチスケール多孔性DPEHAポリHIPEスキャフォールドの形態特性

丸みを帯びた形状や明確に定義された細孔などの PolyHIPE 材料の形態学的特徴は、3 つのスキャフォールドのバリエーションすべてで明らかでした (図 2 A)。スキャフォールド材料の細孔径を測定したところ、すべての材料の細孔サイズは類似しており、正に偏っていることが示され、犠牲テンプレートが内部の細孔径の分布に大きな影響を与えなかったことが示されました (図 2B)。

図3 マイクロチャネルの有無にかかわらずDPEHAポリHIPEスキャフォールドの機械的特性

足場の圧縮弾性率、極限圧縮降伏強度、応力-ひずみ曲線の測定値を図3に示す。結果は、-μC、250μC、および500μCのスキャフォールド間の圧縮弾性率に有意差がないことを示唆しました（図3A）。非チャネル材料と比較すると、250μC および 500μC スキャフォールドの両方の最大圧縮強度が大幅に低下しました (図 3B)。すべてのスキャフォールドバリエーションの応力-ひずみ曲線は、強靭な材料のかなりの弾性変形特性を示しており（図3C）、そのJ字型の非線形曲線は、ポリHIPEおよびその他の生体材料の引張応力-ひずみ曲線を代表していました。 250μC および 500μC のスキャフォールドは両方とも、所定のひずみ値でより低い応力値を示し、材料にマイクロチャネルを導入すると機械的応答が変化することを示しています。

図4 マルチスケール多孔性DPEHAポリHIPEスキャフォールドのin vitro評価

スキャフォールド内のマイクロチャネルが生体材料内での細胞の移動とコロニー形成を促進できるかどうかを調べるために、MG63 骨肉腫細胞をスキャフォールド表面に播種し、最大 28 日間培養しました (図 4A)。 H&E染色では、チャネルのないスキャフォールドと比較して、細胞がより多くの内部領域に浸潤していることが示されました。対照的に、チャネルのないスキャフォールドでは、スキャフォールド表面近くの空隙に浸潤した細胞はわずかでした（図4B）。 SEMにより個々のチャネル内に細胞が存在することが確認され、密なECM層がチャネル表面と空間全体に広がっていることが観察されました（図4C）。レザズリン還元アッセイを使用して、4週間の培養後のスキャフォールド内の細胞生存率と増殖を測定した（図4D）。結果は組織学的所見と一致しており、スキャフォールドは培養期間を通じて高い生存率を示しました。

図5 DPEHAポリHIPEスキャフォールドにおけるBMP-2の積載効率と累積放出プロファイル

次に、本研究では、BMP-2 を搭載したポリ HIPE スキャフォールドの負荷と放出を調査し、移植後の可能性のある放出プロファイルを推定しました。すべてのスキャフォールドで比較的高い荷重効果が観察され、-μC、250μC、および500μCチャネルスキャフォールド間で荷重効率に大きな差はありませんでした（図5A）。最初の24時間以内に、すべてのスキャフォールドは、総装填BMP-2の低いバースト放出を示し、500μCスキャフォールドはBMP-2の累積放出率が最も高く、次いで250μC、-μCスキャフォールドは最も低い放出プロファイルを示した（図5B）。

図6 マイクロチャネルDPEHAポリHIPEスキャフォールドにおけるMSCの浸潤と骨形成分化

マイクロチャネルPolyHIPEスキャフォールドをMSC単層上に堆積させ、細胞をBMP-2を含む骨形成分化培地中で3週間培養した（図6A）。培養21日目に、H&E染色により、マイクロチャネルPolyHIPEスキャフォールド内の細胞は、非チャネルPolyHIPEスキャフォールドと比較して、より内部の領域に浸潤していることが示されました（図6B）。さらに、チャネルスキャフォールドへの細胞浸潤が高かったため、後期骨芽細胞分化マーカーであるオステオカルシンのレベルが高かった（図6C、D）。

図7 頭蓋骨欠損部に移植されたDPEHAポリHIPEスキャフォールドの血管新生研究

この研究では、高解像度X線CTと組み合わせたMV-122マイクロインジェクションを使用して、犠牲テンプレートポリHIPEスキャフォールドによって得られた3次元血管ネットワークを観察しました。血管は、ステント非荷重面を取り囲み、ポリHIPEステントの側面を取り囲むように上面と下面に隣接していました。 -μC/- BMP-2 ステントの血管は主にステントの外側表面に存在していました。対照的に、250μC/-BMP-2および500μC/-BMP-2スキャフォールドでは、スキャフォールド全体にわたって広範囲にわたる相互接続された血管浸潤が認められた（図7A、B）。

図8 マイクロチャネルDPEHAポリHIPEスキャフォールドによる骨形成の定量的研究

次に、インプラントを低解像度（20μm）でマイクロCTでスキャンし、スキャフォールドによって誘発された新しい骨の成長を定量化しました（図8A）。 BMP-2を含まないスキャフォールドでは、非チャネルグループとチャネルグループの間で、欠損被覆率、総新骨量、および垂直骨増加に関して有意差は見られませんでしたが、すべてのBMP-2グループでは、欠損被覆率が向上し、新骨形成が増加しました（図8B、D）。さらに、より大きなチャネルを持つスキャフォールドでは、より小さなチャネルを持つスキャフォールドと比較して骨形成が有意に増加しました（図 8C）。 BMP-2 を含むがマイクロチャネルを含まないスキャフォールドと比較すると、BMP-2 とマイクロチャネルを含むスキャフォールドの骨増強量は約 10 倍増加しました (図 8D)。これは、マイクロチャネルが新しい骨の形成を著しく促進したことを示しています。次に、頭蓋骨組織を組織学的に処理し、マッソン染色で染色して、ポリHIPEスキャフォールド内の新しい骨の形成と細胞浸潤をさらに調べました（図8E）。

全文の要約<br /> 要約すると、この研究では、エマルジョンテンプレートと抽出可能な 3D 印刷を組み合わせて、骨組織工学用の多孔質のポリマースキャフォールドを準備しました。得られたスキャフォールドには、エマルジョンテンプレートによって生成された完全に相互接続された微細孔ネットワークと、直径 250 または 500 μm の相互接続されたメッシュ状のマイクロチャネルネットワークがあります。試験管内では、骨肉腫細胞 (MG63) はマイクロチャネルスキャフォールドに浸透し、スキャフォールドの内部を満たす能力が向上しました。同様に、骨由来の MSC は単層培養から非チャネル足場へと上方に移動し、増殖して骨形成マーカーを示すことができます。マウス頭蓋骨欠損モデルの結果、骨誘導因子BMP-2を添加するとマイクロチャネルスキャフォールドの骨誘導効果が大きくなり、マイクロチャネルスキャフォールドが血管新生を促進することが示されました。 500 μm + BMP-2では、頭蓋骨の欠損は8週間後にほぼ完全に閉じました。結論として、この研究の結果は、エマルジョンテンプレートとネガティブモールドチャネルの組み合わせにより、骨組織工学のための有望な足場が生成されることを示しています。

ソース：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2024.07.038

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