南開大学「ACS Nano」：ルチンナノ粒子光阻害剤が効率的な光ベースの生物学的3Dプリントを促進

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

デジタル光処理（DLP）3D印刷技術は、高解像度と高速印刷で大きな注目を集めています。正確な層ごとの投影によって印刷し、生体材料の正確な空間配置を実現できます。現在、組織工学や再生医療に欠かせないツールとなっています。しかし、光重合に基づく印刷方法では、高い忠実度は光と材料の相互作用の正確な制御に依存します。 DLP 印刷プロセスでは、固有の光散乱と不正確な硬化深度制御により、設計領域外でフリーラジカル反応が発生します。これらの過剰な重合反応により、印刷されたモデルに歪みや歪みが生じ、製造された構造の忠実度に大きな影響を与える可能性があります。意図しない重合の悪影響を軽減するために、これまでの研究では、光吸収剤を追加して光の分布を空間的に制限し、単一層の設計領域に光を最大限に集中させて印刷精度を向上させることが多かった。しかし、この光吸収ベースの戦略では励起光のエネルギーが大幅に消散し、印刷速度が低下します。また、細胞が多数存在する環境では機能しにくくなります。原因を突き止めるためには、より包括的かつ効率的な戦略として、光吸収による光の分布を制限するだけでなく、フリーラジカルとの反応による設計領域内のフリーラジカル反応を厳密に制限し、処理精度をさらに向上させる必要があります。同時に、高精度、迅速性、細胞親和性を備えた効率的なバイオ製造モデルを実現するために、印刷速度の向上と適切な細胞適合性も考慮する必要があります（図1）。

これを踏まえ、南開大学の孔徳玲教授と博士研究員の董先浩氏は、天津第一中心病院の樊孟院長と共同で、ACS NANOに「ルチンナノ粒子光阻害剤による効率的な光ベースのバイオプリンティングと高度なバイオメディカルアプリケーション」と題する研究論文を発表しました。最も安価で入手しやすい天然フラボノイドであるルチンを使用し、マイルドで環境に優しい水溶液環境での簡単なワンステップ自己組織化法により、新しいタイプの水溶性光阻害添加剤であるルチンナノ粒子 (Rnps) が開発されました。 Rnps は光吸収プロセスとフリーラジカル反応を同時に実行できるため、散乱効果を抑制し、印刷精度を向上させることができます。

図1 Rnpの調製プロセスと光ベースのバイオプリンティングにおける光阻害剤としての特性の概略図

著者らは、ルチン粉末をNaOH溶液に溶解し、その時点でルチンはルチンナトリウム塩（NaR）の形で存在し、その後、pHを調整してルチンとNaRが分子間自己組織化を起こしてRnpを形成できるようにしました。光吸収剤タートラジン（タール）は、生体適合性が優れているため、さまざまなバイオ製造で広く使用されています。そこで著者らはタールを対照として選択し、405nm印刷波長光に対するRnpsとタールの吸収能力を比較し、異なる濃度でのRnpsのフリーラジカル消去能力を検出しました。結果は、Rnps の 405nm 光吸収能力が Tar に匹敵し、水中での ABTS フリーラジカル消去能力が優れていることを示しています。これは、光フリーラジカル印刷におけるその効果的な機能につながります (図 2)。

図2 Rnpの合成と特性
バイオインクにおけるRnpsの特定の役割を検証するために、著者らは5% GelMA (EFL-GM) を例にとり、レオロジー特性、機械的特性、安定性、印刷速度など、Rnpsの濃度が異なるバイオインクの特定の特性をテストしました。その後のテストのために、EFL ブランドの DLP 生物 3D プリンター (EFL-BP8601 Pro) を使用して印刷します。実験結果は、Rnp の添加が印刷されたスキャフォールドの機械的特性に影響を与えないことを示しています。光のみを吸収するタールと比較して、Rnps を添加すると、印刷の層間均一性が向上し、印刷プロセス中の過剰なフリーラジカル反応によって引き起こされるインク粘度の上昇も抑制されます。さらに、0.1% Rnps を添加したバイオインクは調製速度が速く、バイオプリンティングへの応用に有益であることが示されました (図 3)。

図3 感光性バイオインク配合と印刷性能の最適化
RNP が印刷解像度とパターン忠実度を向上させる能力を実証するために、著者らはスポーク状のパターンを印刷することによって印刷の横方向解像度を評価しました。 Rnps 濃度が増加するにつれて、忠実度の向上が観察され、0.1% Rnps グループで得られた最高の印刷可能解像度は、0.1% Tar グループを大幅に上回りました。印刷精度の向上は、RNP の光吸収とラジカル消去プロセスの同時実行によるものであり、この戦略により、印刷精度とパターン詳細の忠実度が効果的に向上したことを示しています。次に、著者らは多層垂直チャネル構造の製造における Rnp の役割を研究しました。直径 2 mm および 1 mm のチャネルを印刷する場合、0.1% Rnps グループでは 0.1% Tar グループと比較して過剰硬化とチャネルの詰まりが大幅に減少しました。これは、Rnps が印刷プロセス中にインクの粘度の上昇を抑制したという事実に関連しています。結果の分析により、より微細な細孔構造を印刷する場合、Rnps は従来の光吸収剤よりも多くの利点があることがわかりました (図 4)。

図4 Rnpsを豊富に含むバイオインクによる印刷解像度と構造忠実度の向上
バイオプリンティングでは、細胞の生存と増殖を維持するためにバイオインクの細胞適合性が重要です。著者らは、細胞播種と細胞ベースの印刷にヒト人工多能性幹細胞由来内皮細胞（hiPSC-EC）を使用しました。印刷精度、速度、細胞適合性に基づいてスクリーニングした後、0.1% Rnp を含むバイオインクが最終的に次の実験に選択されました。ルチンには、抗炎症作用、ミトコンドリア代謝の調節、顕著な抗アポトーシス能など、さまざまな有益な生物学的活性があることが示されています。 Rnps が抗酸化調節能力を保持しているかどうかを検証するために、著者らは、Tar または Rnps で処理した後、H2O2 を使用して細胞の酸化を刺激し、細胞内の ROS とスーパーオキシドの濃度、およびミトコンドリア膜電位レベルを測定しました。著者らはqPCRによって抗酸化物質/抗アポトーシス関連遺伝子の発現の変化も検証した。結果から、Rnp は細胞内のフリーラジカルの除去に関与するだけでなく、細胞修復を媒介し、アポトーシス抵抗性を高め、細胞に酸化ストレスに抵抗しアポトーシスを回避する優れた能力を与えることが確認されました (図 5)。

図5 Rnpの添加によるバイオインクの細胞適合性、印刷忠実度、抗酸化特性の改善
Rnps は、複雑な構造の製造やマルチマテリアル印刷でも優れたパフォーマンスを示しました。著者らは、Rnp を含むバイオインクを使用して、TPMS 構造を持つ複雑な足場を作製することに成功しました。得られた構造的特徴は、厚さが 50 ～ 150 μm の薄壁で、細部まで高解像度を示しています。同時に、Rnps はさまざまなバイオインクと良好な互換性があるため、ピラミッドモデルに示されている連続勾配材料の作成や、ルービックキューブモデルに示されているマルチマテリアル統合印刷など、複数の材料の正確な空間分布を実現するためのマルチマテリアル作成において役割を果たすことができます。 EFL が開発したマルチマテリアル DLP バイオプリンター (EFL-BP8601 Mix) は、構造が複雑なマルチマテリアルモデルを作成するためのプラットフォームを提供します。気管モデル、肝小葉、手のひらモデルなどの臓器構造のバイオニック構築において、著者らは Rnps ベースのマルチマテリアル印刷を使用してこれらの臓器の構造の複雑さをシミュレートしました。この印刷方法の正確な薬剤充填への応用を実証するために、著者らは、複雑な「NKU」埋め込み構造を持つ錠剤と、統合された複数の薬剤充填を備えた錠剤モデルを設計および構築し、薬剤充填の利便性と高いスループットを実証しました。さらに、著者らは、さまざまな種類の細胞を搭載した中空の二股チューブ構造を印刷することにより、灌流可能な血管のような組織の作成における Rnps ベースの細胞印刷の応用も実証しました。これらの構造の作製が成功したことは、Rnps ベースの印刷方法がさまざまな生物医学的シナリオに応用できる可能性をさらに示しています (図 6)。

図6 複雑な構造の製造とマルチマテリアル印刷におけるRnpsのパフォーマンス
まとめ
本研究では、シンプルで汎用性の高いルチンベースの光阻害剤 Rnps を開発しました。光吸収とフリーラジカル反応を同時に行うことで、DLP 3D 印刷における光散乱の影響を効果的に低減し、印刷の忠実度を向上させることができます。 Tarと比較して、Rnpsを含むバイオインクの印刷速度は1.9倍に向上し、層間露出オーバーは58％減少し、解像度は38.3％向上し、高精度印刷範囲は3倍に拡大しました。この光阻害剤を使用して調製された足場は、優れた細胞適合性と卓越した抗酸化活性を示しました。 Rnps はさまざまなバイオインクに適応可能で、マルチマテリアルおよびマルチ機能のバイオメディカル構造を作成するための理想的なツールです。 Rnp を他のバイオ製造プラットフォームに統合することで、組織や臓器の複雑な in vitro 再構築に対する技術的サポートが強化され、理論モデルから臨床応用への開発が加速される可能性があります。

南開大学生命科学学院の孔徳玲研究グループの修士課程学生の李飛怡、学部生の李欣悦、博士課程学生の戴淑新が、本論文の共同筆頭著者である。この研究は、中国国家自然科学基金のイノベーション研究グループプロジェクトと青年プロジェクト、およびポストドクター基金一般プロジェクトと海河グリーン創造および材料製造研究所によって支援されました。本研究では、EFLブランドの投影型光硬化性生物3Dプリンター（EFL-BP8601 Pro、EFL-BP8601 Mix）とEFLブランドの各種光硬化性バイオマテリアル（EFL-GM、EFL-F127DA、EFL-HAMAなど）を実験に使用しました。研究活動に対するEFLの強力なサポートに感謝いたします。

ソース：

https://doi.org/10.1021/acsnano.4c05380

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