[分析] 骨組織工学の足場構築に使用される3Dプリント技術

骨は自己修復能力が非常に高いのですが、大きな骨の欠損を完全に修復することはできません。世界中で毎年何千万人もの骨欠損患者がいます。腫瘍や外傷によって引き起こされる大きな骨欠損は、臨床現場で骨の修復や移植が行われる主な理由です。骨欠損の治療に最も理想的な材料は自家骨ですが、自家骨の供給源が限られているため、患者の痛みが増大し、臨床ニーズを満たすことができません。骨組織工学の出現により、この困難な問題に対する新たなアイデアが生まれました。骨組織工学の基本的な出発点は、単に「徐々に進行する骨置換」ではなく、「誘導された骨形成」によって骨の修復と再生を達成することです。近年、骨組織工学の研究が深まるにつれ、足場材料の調製やその製造方法も研究の焦点となっている。骨組織工学スキャフォールドの従来の調製方法には、溶液鋳造/イオン溶出、原位置成形、電界紡糸、相分離/凍結乾燥、ガス孔形成などが含まれます。これらのプロセスも比較的満足のいく結果を達成していますが、スキャフォールド材料と孔構造の正確な制御は達成できず、構造形状は骨欠損部位の解剖学的構造と完全に一致できないため、パーソナライズされたインプラントの調製は達成できません。
3D プリント技術の登場により、これらの欠点は効果的に補われ、骨組織工学の足場成形に広く使用されるようになりました。 3D 印刷技術は、ラピッドプロトタイピング技術の一種です。粉末または液体の金属、プラスチック、その他の接着材料を使用して、3 次元デジタルモデルに基づいて層ごとに印刷することで、物理的なオブジェクトを構築する技術です。金型を必要としないため、コンピュータの3次元グラフィックデータに基づいてあらゆる形状の物体を直接「印刷」でき、印刷された物体の内部微細構造さえも制御できるため、骨組織工学スキャフォールドの構築における3D印刷技術の利点を反映できます。 3D プリント技術は骨組織工学の足場の構築において多くの利点がありますが、まだ初期段階にあり、臨床応用においては多くの課題に直面しています。このレビューは主に、骨組織工学スキャフォールド、骨組織工学スキャフォールドにおける 3D 印刷技術、骨組織工学スキャフォールドを構築するための 3D 印刷に使用される材料、および議論の 4 つの部分で構成されています。

1 材料と方法
1.1 出典
第一著者は、英語の検索用語「3次元印刷、組織工学、ラピッドプロトタイピング技術、足場、材料」と中国語の検索用語「3D印刷、組織工学、ラピッドプロトタイピング技術、足場、材料」を使用して、1990年1月から2015年2月までの骨組織工学足場の構築における3D印刷技術の応用に関する論文をコンピューターで検索し、重複する研究を除外しました。外国文書40件、中国文書12件を含む合計52件の関連文書が取得されました。

1.2 包含基準と除外基準
包含基準:
① 論文の内容は、骨組織工学スキャフォールドの構築に関するモノグラフまたはレビュー論文、ならびに3Dプリント技術分野の研究成果に関する論文とします。
② 同じ分野で最近発表された論文や権威ある雑誌に掲載された論文を選択する。
③この記事では、ステント構築における3Dプリント技術の応用と両者の関係について論じ、その特徴と利点を説明し、十分な理由を示しています。
④材料の比較・選択実験を伴う論文のうち、合理的な設計と明確な介入・制御手段を備えた実験設計論文を選択する。
除外基準:
①複製研究。
②実験設計が不合理な論文

1.3 データ抽出
コンピュータースクリーニングにより合計 52 件の論文が取得されました。タイトルと要約を読んでスクリーニングし、中国語と英語の文献での重複報告や、3D プリントや骨組織工学スキャフォールドに関連しない報告を除外しました。

2 件の結果
2.1 含まれる材料の基本情報
包含基準を満たした33件の論文の中には、骨欠損の治療について報告した論文、従来のスキャフォールド作製方法について報告した論文、スキャフォールドに必要な条件について報告した論文、3Dプリント技術の利点と要件について報告した論文、さまざまな材料の特性と応用の進歩について報告した論文、および3Dの限界と将来の開発方向について報告した論文がありました。

2.2 収録データの研究結果の特徴
2.2.1 骨組織工学用スキャフォールド
骨組織工学の3つの基本要素（種子細胞、足場材料、成長因子）のうち、足場材料は、一方ではシグナル分子や標的細胞の運搬体であり、他方では新しい骨の成長のための足場も提供するため、間違いなく重要な役割を果たします[8]。骨組織工学において、理想的な足場材料には以下の条件が必要です。
① 骨伝導性：新しい組織の成長のための経路または媒体を提供する材料の能力。
② 骨誘導性：この物質は骨組織の成長を刺激することができます。
③生体適合性に優れ、種子細胞の接着、増殖、分化を促進します。
④生分解性が良好です。
⑤十分な機械的性質を有する。
⑥ 立体的な多孔質構造により、種子細胞の成長に適した空間を確保できます。
⑦加工や消毒等が容易

ブラケットの設計では、次の 3 つの側面を考慮する必要があります。
① 細胞の接着、分化、増殖、移動の基盤となり、スキャフォールドの細孔サイズや構造、多孔度、表面化学特性などが影響要因となります。
② 適切な機械的強度。
③置換部位の解剖学的形態に適合する。

図1 3Dプリントの基本プロセス

図の説明: 図の A と B はステップ 1 と 2 です。ローラーが作業台に原料粉末の薄い層を広げます。C はステップ 3 です。ノズルが粉末ベッドにバインダーを含む液滴を局所的に噴霧し、バインダーの周りの粉末がバインダーと結合して、バインダーの周りに噴霧された粉末が部分的に固化し、最終的な 3 次元構造の小さな部分を形成します。D はステップ 4 です。原料粉末で覆われたピストンが上昇し、サンプル粉末で覆われたピストンが下降して新しい粉末層の敷設を開始します (ステップ 2 を繰り返します)。これを 3D 構造全体が印刷されるまで繰り返します。
さらに、細胞の急速な拡散と細胞栄養素の流れを促進し、細胞の移動を促進するためには、3D 骨スキャフォールドの多孔度は 40% ～ 60% より大きくする必要があると一般的に考えられています。したがって、スキャフォールドを設計および準備する際には、骨組織工学スキャフォールドの要件に注意を払い、最も適切な方法と材料を選択する必要があります。

2.2.2 骨組織工学用スキャフォールドにおける3Dプリント技術
3D 印刷技術の概要: 3D 印刷技術は、1989 年に MIT の Emanual Sachs らによって初めて報告されました。オンデマンドの液滴噴射技術です。 3D 印刷システムは、安価な市販のプリンターシステムを改良したもので、Z 軸モーションコントロールシステムが追加され、システム独自のインクジェットデバイスまたは改良されたシリンジアレイを使用して、材料の個別の形成を実現します。この技術を使用して骨組織工学スキャフォールドを準備する場合、骨修復機能を持つ粉末材料とその中に保存されたバインダーを通常プリンターで層ごとに印刷してモデル構造を形成します。バインダーは粉末粒子と層を結合してより安定させ、最終的に必要な骨組織工学3次元スキャフォールド材料を形成します。印刷された材料の微細構造は、バインダーの流量、印刷速度、堆積位置の変更など、多くのパラメータを通じて調整できます。

他のラピッドプロトタイピング技術と比較して、3D プリント技術には次のような利点があります。
①高精度：つまり高解像度。
② 種子細胞と足場材料を同時に印刷できるため、全体的な3次元構造の構築が容易になります。
③施工スピードが速い。
④ 個別のニーズに合わせてオンデマンドでモデルを構築できます。
⑤ 必要に応じて特定の多孔度と架橋を設定することができ、これによりスキャフォールドの生物学的および機械的特性が大幅に向上し、骨組織の成長と骨折治癒が促進されます。また、材料の観点から見ると、バインダーと組み合わせることができれば、ほぼすべての種類の粉末を印刷に使用できます。

3D プリントのスケーラビリティにより、印刷されるオブジェクトのサイズは数ミリメートルから数メートルの範囲になります。これらの特徴により、3Dプリントの利用の自由度が大幅に向上します[14]。これらの利点は、骨組織工学スキャフォールドの構築における 3D 印刷技術の応用の理論的根拠を提供し、この方法に多くの研究を投資する意義にもなります。 3D 印刷技術の基本的なプロセスは、粉末の拡散、単層印刷、ピストンの下降、往復運動、印刷形成の 5 つの段階に簡単にまとめることができます。基本的なプロセスを図 1 に示します。

ブラケット構造に適用される 3D プリントの要件: ブラケット構造に 3D プリントを適用する場合、使用する粉末と接着剤は特定の条件を満たす必要があります。粉末は一定の流動性、安定性、濡れ性を持たなければなりません。粉末とバインダー間の反応性も 3D プリントにおいて重要な役割を果たします。

⑴ 流動性：使用する粉末材料は一定の流動性を持っている必要があります。流動性が良好であれば、ローラーが粉末を薄い層に広げることができ、余分な粉末を最終的に除去しやすくなります。さらに、優れた流動性により高解像度の印刷効果が得られ、これも 3D プリントの高精度特性の深い理由の 1 つとなっています。流動性は主に粒子のサイズと形状によって決まります。粒子が小さく、形状が球状に近いほど、流動性が高くなります。研究によると、解像度は粒子サイズの少なくとも 2 倍であるため、高精度の印刷効果は微粉末の選択に依存します。しかし、粉末が小さすぎると、特殊な内部力により凝集しやすくなり、流動性が低下します。したがって、流動性と解像度の間でバランスを見つける必要があります。

⑵安定性：接着剤をスプレーする際には、粉体の安定性が特に重要です。ノズルがバインダーを噴霧すると、約 30 pL の体積の液滴が 6 m/s の速度でルースパウダー層に衝突し、液滴が底にある弾道軌道に似た窪みが形成されます。速度が 1 m/s 増加するごとに、影響を受ける領域の直径は 5 ～ 10 μm 増加します。再コーティングすると、最上層がせん断力の影響を受け、印刷された薄層構造がずれて、最終製品の精度と完全性に影響を与える可能性があります。この横方向の変位に加えて、重力によって発生する圧縮荷重により、印刷された薄層構造の縦方向の変位が発生します。したがって、安定性を改善し、これらの影響を回避するには、少量の水を追加したり、粉末層の充填密度を高めたりして、結合強度を改善することから始めることができます。

⑶ 濡れ性：粉末の濡れ性はもう一つの重要な要件であり、印刷精度と三次元構造の本来の強度に直接影響します。ただし、濡れ性が強すぎると接着剤が広範囲に拡散し、印刷解像度が低下します。一方、濡れ性が悪すぎると、接触角が大きくなったり、接着剤の粘度が高くなったりして、隣接する層の間にずれが生じ、最終的に機械的完全性が低下する可能性があります。粉末の濡れ性は、粉末とバインダーの接触角、バインダーのスプレー速度、粉末床表面の地形、粉末とバインダーの化学的相互作用など、多くの要因によって決まります。現状では、特に粉体の場合、物体の接触角を定量的に分析するための信頼性の高いデータを取得することは困難です。動的液滴形状解析、毛細管上昇法、粒子流動法など、粒子とバインダー間の相互作用を研究する方法はいくつかありますが、まだ初期段階にあり、十分に理解されていません。

⑷ 反応性：粉末とバインダーの反応性も 3D プリントにおいて重要な役割を果たします。反応性が高すぎると接着剤の広がりが制限され、反応性が低いと接着剤をより集中的に塗布する必要があります。したがって、反応性は層間の接着に影響を与え、最終的には印刷の精度に影響を与える可能性があります。 3D プリント後に焼結する必要があるブラケットの場合、燃焼によりバインダーが損傷するため、最終製品の強度が低下します。したがって、十分な機械的安定性と強度を確保するためには、接着剤の濃度を下げる必要があります。

2.2.3 骨組織工学用スキャフォールドの3Dプリントに使用される材料<br /> 骨組織工学スキャフォールドの構築に使用される材料には、その特性に応じて、主に人工合成ポリマー、天然高分子ポリマー、バイオセラミックス、およびそれらの混合物が含まれます。バイオセラミック材料は現在最も広く使用されており、最大の応用可能性を秘めています。これについては以下で詳しく説明します。

人工合成ポリマー:このタイプの材料は、ポリ乳酸 (PLA)、ポリグリコール酸 (PGA)、およびそれらの共重合体 (PLGA) で代表されます。このタイプのポリマーは、さまざまな構造形状に加工できる熱可塑性材料であり、分子量を調整し、異なる重合方法と成形手段を選択することにより、材料の機械的特性と分解速度を調整および制御できます。 PLA と PGA は、分解生成物が無毒で生体適合性が優れているため、米国 FDA によってインプラントとしての使用が承認されています。

Vacanti らは、軟骨細胞の in vitro 培養のマトリックス材料として初めて PGA と PLA を使用し、組織工学的手法によって新しい軟骨を得ることに成功しました。 Sherwood らは、3D プリント技術を使用して、上層が PLGA/PLLA で構成され、下層が PLGA/TCP で構成される軟骨骨複合スキャフォールドを準備しました。研究では、軟骨細胞は足場の軟骨部分に付着することを好み、培養6週間後には軟骨組織の形成が見られることがわかった。スキャフォールドの骨形成領域の機械的強度は、ヒトの新生海綿骨と同程度の大きさに達することができます。この研究は完全な関節再建のための新しいアプローチを提供します。

Tayらは、3Dプリント技術を使用してポリカプロラクトンとポリビニルアルコールの混合粉末を擬似足場にし、その後、粒子ろ過法を使用してポリビニルアルコールを除去し、多孔質の足場を得ました。濾過された足場は緩く柔らかく、細孔構造は高い連結性を持っています。しかし、人工的に合成されたポリマーは一般に水に溶けにくいため、溶解するには有機溶媒（クロロホルムなど）が必要になります。クロロホルムは有毒な溶剤であり、体内に残留すると毒性の影響を及ぼす可能性があります。クロロホルム抽出技術を使用すればクロロホルムを減らすことはできますが、それでもステント内にクロロホルムが残留するリスクは残ります。さらに、有機溶剤を使用するとコストと製造の難しさが大幅に増加し、医療グレードのステント材料の大規模なバッチ生産に問題が生じます。

天然ポリマー:天然ポリマーには、コラーゲン、フィブリン、キチンとその誘導体、アルギン酸塩が含まれます。これらの天然ポリマーは生体適合性が高く、細胞接着、増殖、分化を促進する細胞認識シグナル (特定のアミノ酸配列など) を持っています。天然ポリマーは一般に水溶性であり、溶解に溶剤を必要としない接着剤と組み合わせることができます。そのため、医療用ステント材料の印刷には多数の天然ポリマーが使用されています。しかし、大量に入手することが困難であったり、分解を制御することが困難であったりするなどの欠点があり、組織工学において骨芽細胞移植用のキャリアとして単独で使用することは困難です。しかし、最大の欠点は、一定の機械的強度が不足しており、骨芽細胞培養のマトリックス材料として単独で使用することが難しいことです。埋め込みや添加剤として使用できます。

バイオセラミックス:リン酸三カルシウム (TCP) とヒドロキシアパタイト (HA) に代表されるリン酸カルシウムセラミックスは、広く使用されている骨置換材料の 1 つです。どちらも優れた骨伝導特性を持ち、さまざまな程度に宿主の骨に統合できます。リン酸三カルシウムは人間の骨によく含まれており、骨の修復に適した材料です。人体に移植された後、リン酸三カルシウムは体内で分解されて新しい骨を形成し、比較的豊富なCaとPを供給することができます[25]。この特性により、リン酸三カルシウムをベースにした人工骨材料の研究と応用は、今日、骨組織工学スキャフォールドの開発においても活発な分野となっています。しかし、スキャフォールドの単純な印刷では、最終的な骨形成効果に対する期待を満たすことができないようです。

近年、スキャフォールドへの薬剤の充填が研究のホットスポットとなっており、薬剤を添加することで微小環境を制御し、骨芽細胞の増殖を促進することができます。 Yuan Jingらは、3Dプリント法を用いて、β-リン酸三カルシウム粉末を原料とし、リン酸二水素カリウムを結合剤とした薬剤（デキサメタゾン、β-ホスホグリセリン酸ナトリウム、ビタミンC）を配合した骨組織工学用スキャフォールドを作製し、薬剤を配合していないスキャフォールドと比較しました。結果、薬剤を配合したβ-リン酸三カルシウムスキャフォールドは15週間以内に基本的に完全に分解され、これは海綿骨欠損の修復時間と同等であることが示されました。骨髄間葉系幹細胞は薬剤を充填したβ-リン酸三カルシウムスキャフォールドの表面に接着し、スキャフォールドの奥深くまで浸透しました。細胞はよく成長し、活発に増殖し、細胞アルカリホスファターゼ活性が向上しました。これは、薬剤を充填したβ-リン酸三カルシウムスキャフォールドが良好な細胞適合性を持っていることを示しています。さらに、2 つのバイオセラミック材料を混合すると、比較的良好な結果が得られます。周らは、リン酸カルシウム（CaP）と硫酸カルシウム（CaSO4）の混合粉末を原料として使用し、3Dプリントを使用して組織工学の足場を印刷しました。結果は、リン酸カルシウムと硫酸カルシウムの比率が高いほど、足場が強くなることを示しました。

ハイドロキシアパタイトは、骨組織工学の足場にも広く使用されている材料です。 Fierzらは、ハイドロキシアパタイトと水溶性接着剤を材料として、3Dプリント技術を採用して3種類の円筒形中空骨スキャフォールドを作製した。スキャフォールドの直径は3.9〜4.2mm、中心管の直径は0.70〜0.87mmで、すべてのスキャフォールドの微細孔含有量は70％に達した。組織学的分析により、骨芽細胞刺激前駆細胞がスキャフォールドによく付着できることが判明した。ハイドロキシアパタイトの主な利点は、骨形成タンパク質に対する強い親和性です。Jun らは、ハイドロキシアパタイト骨組織工学スキャフォールドに骨形成タンパク質 2 を含むコーティングを追加し、骨形成タンパク質 2 を含まないハイドロキシアパタイトスキャフォールドと比較しました。その結果、実験群の骨芽細胞がより活発になり、骨組織がよりよく成長し、骨移植の代替品としてより適していることが示されました。ハイドロキシアパタイトの弱点は脆さであり、純粋なハイドロキシアパタイトは容易に吸収されないため、その用途は制限されます。

バイオセラミック粉末の 3D プリントでは、リン酸やクエン酸などの酸が結合剤としてよく使用されます。少量の未反応の酸結合剤残留物は通常、大きな影響を与えません。クエン酸、リン酸、シュウ酸などの酸も通常の人体中に存在し、簡単に除去されます。新しく印刷されたブラケットは非常に脆く不安定です。より安定させるためには、印刷後にリン酸に浸して硬化させるか、焼結してリン酸カルシウム石を熱分解し、徐々にピロリン酸を形成して硬度を高める必要があります。人工的に合成されたポリマー材料は、分解生成物が無毒で生体適合性も優れているため、骨組織の足場材料として広く使用されています。しかし、水溶性が低いため有機溶媒の導入が必要となり、足場材料に毒性物質が残留するリスクが高まり、開発が制限されます。天然ポリマーは水溶性が高く、有機溶剤を使用する必要がありません。最大の欠点は機械的強度が不足することですが、材料の埋め込みや添加剤として使用できます。バイオセラミックスは、優れた生体適合性と十分な機械的強度を兼ね備えており、骨組織工学において最も広く使用されているスキャフォールド材料の1つとなっています。近年、スキャフォールドへの薬剤充填に関する研究により、バイオセラミックスに新たな発展の方向性が示されました。

3 議論
骨組織工学の足場における 3D 印刷技術の応用は満足のいく結果を達成しており、計り知れない可能性を秘めています。しかし、現時点では、骨組織工学スキャフォールドにおける 3D プリントの応用は完璧ではなく、その問題点や欠点をまだ認識する必要があります。 3Dプリントは高価です。印刷設備と操作のコストが高いだけでなく、最初の粉末の準備から後の焼結プロセスまでの材料コストも無視できません。頭蓋骨の模型の印刷コストは1,000〜2,000元にもなります。 000米ドル、このコストは中国の発展にも現実的ではありません。特別な技術者の不足もあります。これは、将来、3D印刷がより広く使用されているために改善する必要があります。 3D印刷後の足場などの複数の側面は、特定の生体適合性を維持する必要があります。

骨組織工学スキャフォールドに適用される 3D プリント技術の将来の開発方向には、主に次の 3 つの側面が含まれます。
① 構造設計と製造：本製剤は、通常の骨組織と同様の物理的、化学的、生物学的機能を持ち、一定の生体適合性と生物学的強度を備えています。
② 複数の細胞と成長因子の相互作用：さまざまな細胞と成長因子の影響を考慮し、印刷ユニットを適切に拡張して、血管を備えた骨の足場を直接印刷することができます。
③生物学的スキャフォールドの保存と活性維持：生体外骨スキャフォールドの細胞活性を最大限に維持する方法を十分に考慮する必要がある。

課題と希望は共存しています。この記事では、骨組織工学の足場への 3D 印刷技術の応用には大きな展望があると見ています。既存の課題を受け入れ、徐々に克服することによってのみ、その最大の価値が発揮され、将来の骨欠損の治療に効率的で効果的な治療法が提供されることになります。 3Dプリント技術の継続的な発展、骨組織工学の足場材料に対する人々の研究、そして工学と医学の継続的な融合と相互推進により、3Dプリントは近い将来、骨組織工学の足場構築の分野で確実に輝くことになるでしょう。

編集者: Antarctic Bear 著者: Yu Qiang、Tian Jing

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