パターン化されたナノファイバー膜 + ハイドロゲルで生物学的 3D プリント人工皮膚代替品を準備

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

バイオ 3D プリンティングは、人工皮膚組織を構築し、天然皮膚の構造と機能を再現する上で利点があります。多くの研究で、創傷治癒における印刷された皮膚代替品の成果が改善されたことが示されていますが、ハイドロゲルインクを使用して、複雑な構造、機械的特性の模倣、適切な細胞環境を備えた 3D バイオプリント構造を製造することは依然として困難です。

コラーゲンナノファイバーがストレスに耐え、細胞の行動を調節する能力にヒントを得て、中国科学院深圳先進技術研究所の趙暁麗氏のチームは、パターン化されたナノファイバー膜を印刷されたハイドロゲル足場に導入し、複合人工皮膚代替物（CASS）を製造した。コラーゲンを模倣したナノファイバー膜により、CASS の引張強度と破損耐性が効果的に向上し、縫合して皮膚欠損部に安全に移植できるようになりました。同時に、パターン化されたナノファイバー膜は、細胞の行動を導く生物学的手がかりも提供します。このように、CASS は再上皮化とコラーゲン沈着を促進することにより、マウスおよびブタモデルにおける大きな皮膚欠損の再生を効果的に促進します (図 1)。

関連する研究成果は、2024年6月28日にACS Nanoに「パターン化されたナノファイバーフィルムの統合による機械的特性の向上と細胞挙動の制御を備えた人工皮膚代替品の3Dバイオプリンティング」というタイトルでオンライン公開されました。

図1 バイオ3DプリントCASSとその創傷治癒への応用の概略図

1. ハイブリッドハイドロゲルインクの調製と特性評価

複合人工皮膚代替物（CASS）は、パターン化されたナノファイバー（PN）フィルムを印刷されたハイドロゲル足場に導入する生体模倣戦略を使用して製造されました。著者らは、天然の皮膚組織の化学組成を模倣するために、ゼラチン (Gel-MA) とヒアルロン酸 (HA-MA) で構成されたハイブリッドハイドロゲルを印刷インクとして選択しました。そこで、まずこのインクの印刷性と物理化学的性質を調査しました。レオロジー試験、実際の印刷効果評価、分解速度評価、細胞実験、動的レオロジー分析を通じて、良好な生体適合性と高い機械的特性を持つG10H2ゲル（すなわち、Gel-MA濃度10、HA-MA濃度2）がハイドロゲルインクとして選別されました（図1）。

図1 ハイブリッドハイドロゲルインクの特性

2. PNフィルムの作製と特性評価

PN フィルムは、CASS に統合してその機械的特性を改善し、コラーゲンを模倣した生物学的手がかりを提供するように設計されています。ナノファイバー構造が密集した一般的な電界紡糸フィルムは、フィルムを介した細胞の移動を妨げる可能性があるため、貫通孔を有するパターン化された電界紡糸ナノファイバーフィルムを構築し、直径2.0 mmの貫通孔を有するパターン化されたステンレス鋼板上で電界紡糸によって収集しました（図2A）。 SEM および細胞実験により、P15G1.5-5 フィルム (すなわち、ポリ乳酸グリコール酸 (PLGA) 含有量 15% w/v、Gel-MA 含有量 1.5% w/v、回転時間 5 分) では、ヒト真皮線維芽細胞 (HDF) が細孔を通過して培養皿に到達できることが示されたため、このフィルムがその後の実験に選択され、PN フィルムと名付けられました。

図2 PNフィルムの特性

3. PNフィルム強化複合人工真皮（CAD）の機械的特性

CAD は、基底層、真皮、網状真皮を含む外側から内側にかけての層状の天然皮膚組織をシミュレートするように、勾配孔を備えたハイドロゲルスキャフォールドを印刷し、その中に PN フィルムを挿入することによって構築されました。本論文では、3 つの勾配ハイドロゲルチャンバーと 2 つの PN 膜をハイドロゲル-膜-ハイドロゲル-膜-ハイドロゲルの順序で使用して簡略化されたモデルを作成しました (図 3A)。光学写真ではハイドロゲル区画の多孔度の勾配が観察された（図3B）。引張応力下での CAD とハイドロゲル真皮 (HAD) の比較では、CAD の引張抵抗が HAD よりもはるかに強いことが示されました。機械的特性試験では、PN膜の挿入により、引張応力、破壊抵抗、および亀裂抵抗の点でCADの機械的特性が効果的に改善されることが示されました（図3C-F）。さらに、CAD はヌードマウスの皮膚に縫合することができ、臨床皮膚移植と同様に、全層創傷を包括的に覆い、創傷の端にしっかりと接着します (図 3G)。

図3 複合人工真皮（CAD）の機械的特性

4. ナノファイバー構造は細胞接着を促進し、細胞形態を調節する

PNフィルムはコラーゲンを模倣したナノファイバー形態も示し、細胞の挙動を導く物理的な手がかりを提供しました（図4A）。細胞実験では、PN フィルムがナノファイバー形態のプラットフォームを提供し、細胞の急速な接着を促進し、コラーゲンを模倣した細胞環境を提供することが示されました (図 4B-F)。差次的に発現した遺伝子は、PNフィルムのコラーゲン模倣ナノファイバーが転写遺伝子発現と細胞形態を変化させることでHDFの挙動に影響を与えることを示した（図4G-H）。

図4 ゲルスライスとPNフィルム上に播種したHDFの挙動

5. CASSの構築

CASSは人工表皮と人工真皮で構成されています。人工真皮は、HDF を封入したグラデーションプリントされたハイドロゲルスキャフォールドに PN フィルムの 2 層を統合することによって構築されました。人工表皮は、ヒトケラチノサイト（HKC）を真皮表面に播種し、気液界面培養によって成熟させることによって形成されました。 HDFとHKCはそれぞれ緑色蛍光（CFDA SE）と赤色蛍光（CMTPX）で標識された（図5A）。蛍光画像の分析により、HKCはスキャフォールド表面に分布しているのに対し、HDFはハイドロゲルシルク全体に分散していることが示されました（図5B）。 CASS培養プロセスの写真では、5日間の浸漬培養と10日間の気液界面培養の後、表皮層を持つCASSが正常に作成されたことが示されています（図5C-D）。 HE染色、マッソン染色、サイトケラチン10（K10）蛍光染色画像では、表皮層の厚さが5日目の約20μmから15日目の65μmに増加したことが観察されました（図5E）。これらの発見は総合的に HKC の増殖と分化を示し、表皮層の構築が成功したことを確認しています。

図5 CASS製造

6. マウスとブタにおける創傷治癒試験

大きな皮膚欠損の治療における CASS の有効性は、最初にマウスモデルで評価されました。創傷面積の変化、HEおよびマッソントリクローム染色の結果から、HASS+細胞およびCASS+細胞は、カプセル化されたHDFおよびHKCの助けを借りて創傷治癒を促進する能力が強いことが示されました（図6）。

図6 マウスにおける全層創傷の生体内修復

全層創傷の治療における CASS の役割をさらに評価するために、4 匹の Bama ミニチュア豚が大型動物モデルとして使用されました。豚の背中に12個の正方形の全層皮膚欠損部（4 cm × 4 cm）を作成し、CASS + Cellで治療した創傷は術後42日目に優れた創傷治癒挙動を示しました（図7）。

図7 豚の全層創傷の生体内修復

要約すると、大きな皮膚欠損の創傷治癒を促進するために、勾配多孔性と統合パターン化ナノファイバー膜を備えた 3D バイオプリント CASS が開発されました。 CASS は、優れた引張強度、耐破壊性、耐継ぎ目性を備えており、気液界面で培養後、表皮をうまく構築します。 Balb/cヌードマウスとBamaミニブタモデルでは、CASSは大きな皮膚欠損の再生を効果的に促進し、組織学的分析ではCASS治療した創傷では創傷上皮化とコラーゲン沈着がより良好であることが示されました。結論として、3D バイオプリント CASS は大きな皮膚欠損の治療に大きな可能性を秘めており、本研究におけるナノファイバー膜の統合は、優れた機械的特性と適切な細胞環境を備えたバイオプリント構造を構築するための有益な戦略を提供します。

ソース：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c04088

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