創傷治癒における原位置発泡と3Dプリント多孔質足場の利点

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

マクロ多孔性ハイドロゲルは、栄養素や老廃物の透過性、細胞透過性の向上、免疫原性の最小化により、バイオメディカル用途、特に再生医療の分野で大きな可能性を示しています。しかし、多孔質ハイドロゲルを製造する従来の方法では、二次的な後処理手順や危険な試薬が必要となり、生理活性因子と細胞を同時に製造することは不可能です。

コネチカット大学ヘルスセンターのアリ・タマヨル氏と彼のチームは、皮膚の欠損部に直接欠損部特有のマクロ多孔性スキャフォールドを形成するために、ハイドロゲルフォームを便利かつ継続的に生成して堆積させるハンドヘルドプリンターを開発しました。このハンドヘルドシステムでは、温度制御されたマイクロ流体ホモジナイザーがマイクロ流体ポンプおよびエアポンプと組み合わされ、滅菌空気とゼラチンメタクリロイル (GelMA) を必要な比率で混合します。次に、印刷されたフォームは、統合された光架橋ユニットを使用してその場で架橋され、制御された多孔性を備えた足場を形成します。このシステムは、信頼性が高く均一な GelMA フォームを形成するように最適化されました。得られたフォームスキャフォールドは優れた機械的特性と柔軟性を示し、創傷治癒用途に適しています。体外細胞培養の結果、スキャフォールド上の細胞活動は固体ハイドロゲル上と比較して大幅に増加したことが示されました。生体内プリントされたフォームスキャフォールドにより、生体材料を使用せずにマウスの全層創傷の治癒速度と治癒の質が向上しました。関連研究は、2024 年 9 月 9 日に Advanced Healthcare Materials 誌に「創傷治癒における In Situ 発泡および印刷多孔質スキャフォールドの利点」というタイトルの記事として掲載されました。

1. 革新的な研究内容<br /> ここでは、i) 温度制御オンサイトプリンター、ii) エアポンプ、iii) マイクロ流体ホモジナイザーを統合し、皮膚創傷治療用の高度に制御可能な多孔質フォームスキャフォールドを同時に生成および印刷するシステムを開発しました (図 1)。この方法では、GelMA ハイドロゲル前駆体と空気が、それぞれリニアアクチュエータ押し出しシステムとエアポンプを介してマイクロ流体ホモジナイザーに流れ込み、そこで気泡が GelMA フローに導入され、連続気泡分割によって均質化されます (図 1A)。このコロイドエマルジョンは、出口ノズルを通して現場で欠陥部分に印刷され、その後、内蔵の光架橋ユニットによって架橋されます。多孔質フォームの即時印刷と光架橋により、気泡の不安定性と凝集を防ぎます。このアプローチにより、不規則な形状の創傷や曲面上の創傷の治療が容易になり、残りの組織に適合して接着できるマクロ多孔性スキャフォールドがシームレスに形成されます。走査型電子顕微鏡（SEM）で明らかになったように、フォームの相互接続されたマクロ多孔構造により、細胞の浸潤、増殖、および組織のリモデリングが改善されました（図1A）。このデバイスはコンパクトであるため (図 1B)、リソースが限られた環境でハンドヘルドプリンターとして使用でき、ロボットアームなどの自動制御システムに取り付けて、より正確で高解像度のインプラントの送達を実現することもできます。さらに、当社のプラットフォームは手動による圧縮に依存せず、さらなる自動化を可能にします。

ハンドヘルドワンステップフォームプリンターの開発
図1Bは開発されたワンステップインサイチュフォームプリンターを示しています。このシステムは、5 つの統合モジュール (ハイドロゲル前駆体温度制御システム、電動ハイドロゲル前駆体押し出しシステム、マイクロエアポンプ、マイクロ流体ホモジナイザー、光架橋照明システム) で構成されており、ハウジング内に封入されているため、システム全体がコンパクトなモバイルデバイスになっています (図 1C)。モジュール設計により、プリンターの組み立てと分解が迅速かつ容易になり、前駆体シリンジカートリッジの交換も迅速に行えます。さらに、システムのモジュール性により、システム全体を再設計することなく、異なるサイズの前駆体インジェクターカートリッジ、異なるタイプのモーターの使用、または将来のアップグレードなどのメンテナンスや変更も容易になります。組み立てられた装置は小型（本体寸法：18×5×4cm）かつ軽量（278g）で、片手で簡単に操作・制御できます（図1B）。

図1 皮膚創傷組織再生のためのマクロポーラス足場のワンステップin situ印刷

マイクロ流体ホモジナイザーの設計とフォーム多孔性の最適化
ハイドロゲル前駆体のワンステップ膨張プロセスを容易にするために、コンパクトなマイクロ流体ホモジナイザーが設計され、製造されました（図2A）。これらのホモジナイザーは、3 方向コネクタ、マイクロメッシュアセンブリ、および接続用のルアーロックフィッティングの 3 つの部品を組み立てて作られています。特別に設計された 3 方向コネクタは、迅速な接続のためにルアーロックフィッティングを使用します。2 つのオスルアーロックはハイドロゲルと空気の入力に使用され、下流のメスコネクタはマイクロメッシュアセンブリの接続に使用されます (図 2A)。 3 つのチャネルを含むマイクロ流体ミキサーを通じて、ハイドロゲル前駆体の流れに空気が導入されました。この論文の予備実験では、これらのチャネルにより、単一チャネルの設定よりも効果的にハイドロゲルの流れに空気が導入され、混合され、より均一で高品質の泡が得られることが示されています。 2 番目のコンポーネントはマイクロメッシュアセンブリです。これは、連続的な気泡分割のために互いに 1 mm 間隔で配置された複数のナイロンマイクロメッシュで構成されています。大きな気泡を含む GelMA ハイドロゲル前駆体をマイクロメッシュアセンブリに押し出すと、水相はメッシュを容易に通過しますが、気泡はせん断応力を受けて順次破壊され、均一で細かい GelMA フォームが形成されます (図 2B)。これにより、堆積およびその場での光架橋後に、足場内に均一なマクロ孔が形成されます。メッシュサイズやメッシュ層の数などのマイクロメッシュアセンブリの構成によって、印刷されたフォームの多孔度と細孔サイズの分布が決まります。入口圧力、生体材料の濃度、温度、前駆体の押し出し速度を変えることで、細孔サイズと多孔性をさらに調整できます。細孔構造に対するこの程度の制御は非常に貴重であり、これまでの研究に比べてこの研究が優れている点の 1 つです。マイクロ流体ホモジナイザーの最後のコンポーネントは、さまざまなサイズや形状の印刷針やノズルにすばやく接続するためのメス型ルアーロックエンドです。

図 2 マイクロ流体ホモジナイザーの設計とパラメータの最適化により、制御可能な細孔サイズを持つ多孔質ハイドロゲルの生成が可能になります。

ワンステップ発泡と印刷のデモンストレーション
発泡プロセスの自動化とプロセスパラメータの制御により、このプロセスは再現性が高く、印刷されたフォームの多孔度と細孔サイズの分布を適切に制御できます。このシステムは手動印刷用に設計されていますが、ロボットアームに取り付けてマクロ多孔性スキャフォールドの完全自動ワンステップ印刷も可能にします (図 3)。このコンパクトなシステムにより、多孔質フォームハイドロゲル足場の同時生成、印刷、光架橋が可能になります。ハンドヘルドシステムは、人間工学に基づいたハウジングに収められており、持ちやすく、長時間の操作も簡単です (図 3A)。小型で軽量であるため、手術室や戦場などの資源が限られた環境で外科医が使用するには理想的な装置です。オペレーターは、医療用画像処理やスキャン、計算処理、ツールパス生成などの複雑さを増すことなく、ノズルの先端を操作して、不均一な形状や曲面の傷を覆うことができます。重要なのは、スキャフォールドが現場での架橋により組織に接着するため、追加の固定が不要になり、従来のソフトハイドロゲルスキャフォールドの移植に伴う課題に対処できることです。さまざまな形状の欠陥形状の充填を容易にするために、市販のさまざまなノズル形状やカスタム設計されたノズル形状が利用されました (図 3B)。さまざまなサイズと形状の欠陥を印刷して埋めるデバイスの能力を実証するために、ex vivo シリコン皮膚モデルが作成されました。従来の鈍い先端の金属針のようなルアーロックチップを備えた市販のノズルをマイクロ流体ホモジナイザーの端に取り付けて、狭い傷を埋めることができます。さらに、ルアーロックカップリングを備えたカスタマイズされたフラットファンノズルが設計され、3Dプリントされて、マクロポーラススキャフォールドをストリップパターンでその場で堆積させ、大きな欠陥を迅速に埋めることができました。皮膚生検などで生じた大きな円形の欠損部分を素早く埋めるための大型の円形ノズルも開発されました。

図3 ハンドヘルドおよび自動in-situ印刷のデモンストレーション

ワンステッププリントマクロポーラススキャフォールドの物理的特性評価
次に、ワンステップで作製した多孔質スキャフォールドの機械的特性と生分解性を評価し、固体 GelMA のものと比較しました。機械的特性を評価するために、軸圧縮機械試験を実施した（図4A）。固体および発泡ハイドロゲルの圧縮弾性率は、得られた応力-ひずみ曲線の最初の 10% の傾きによって定量化されました (図 4B)。圧縮試験の結果、フォームの圧縮係数は、本研究チームが以前に報告した機械的撹拌によって生成された GelMA フォームの圧縮係数と類似しており、軟組織の値に近いことが示されました。しかし、予想通り、フォームの圧縮弾性率は、固体 15% GelMA ハイドロゲルと比較して大幅に低くなりました (約 5 kPa 対約 50 kPa)。ハイドロゲルの機械的特性はその多孔性によって大きく左右されるため、ワンステップフォーマーの多孔性を制御する能力は、細胞が受ける微視的圧縮係数と組織またはマクロレベルで感じられる剛性を切り離すために使用できる重要な要素です。さらに、フォームは変形性が高く（図 4C）、荷重がかかった後も元の形状を回復できることも実証しました。さらに、ステントの機械的ヒステリシスと、生理的な体の動きに類似した繰り返し荷重に対する耐久性を評価するために、周期的圧縮試験を実施しました。テストは、約 50% のひずみで最大 20 サイクルの周期的圧縮に対して実施されました。足場は一貫したヒステリシス挙動を示しました。具体的には、最初の3サイクル後には荷重曲線と除荷曲線に明らかな変化は見られず、良好な回復性を示している（図4D）。これは、体の動きによって大きな負担を受ける軟組織インプラントにとって非常に重要です。

図4 ワンステップ印刷法で製造したフォームと固体ハイドロゲルの物理的特性の比較

試験管内生物学的特性評価
多孔質スキャフォールドの生物学的特性を評価するために、それらをヒト真皮線維芽細胞 (HDF) 培養にさらしました。ここで HDF が選ばれたのは、細胞毒性環境に対する初代細胞としての感受性、再生医療におけるヒトとの関連性、および生体内創傷治癒実験への適合性という 3 つの理由によるものです。まず、足場を作製し、その上に細胞を播種して、足場の生物学的挙動を評価しました。この調査は、細胞をホストするためのワンステッププリントフォームの生体適合性と適合性を精査し、同時に本論文の究極の生体内戦略をin vitro 設定に反映するように設計されました。細胞播種研究では、PrestoBlue 生存率アッセイを使用して 5 日間にわたって細胞増殖と生存率を評価しました。図 5A に示すように、蛍光強度測定では、ワンステッププリントフォームと固体ハイドロゲルで処理した細胞の代謝活動が 5 日間にわたって一貫して直線的に増加していることが示されました。興味深いことに、PrestoBlue アッセイでは、ワンステッププリントされたフォームサンプル上に播種された細胞は、固体ハイドロゲルと比較して大幅に高い増殖を示したことが明らかになりました。増殖の増加は、ワンステッププリントされたフォーム構造の多孔質特性によるものと考えられます。この多孔質特性により、細胞の成長のためのスペースが広がり、3D 構造内で細胞増殖が促進されます。この挙動は培養物のアクチン/DAPI染色によって確認された（図5B、C）。固体ハイドロゲルは生体適合性の表面を持ち、明らかな細胞増殖と拡散を示しますが、その小さな固有の細孔によりハイドロゲルへの細胞の浸透が制限され、細胞がサンプル表面上に密な平面層を形成します（図5B）。対照的に、多孔質足場上で培養されたHDFは3次元的に成長した多層構造を形成し、細胞ネットワークを形成した（図5C）。 HDF の非平面的な性質は、顕微鏡写真の暗い領域で示されるように、細孔に向かって下向きに成長する細胞の集中した糸状の拡散によって明らかになります。

図5 ワンステッププリントマクロポーラススキャフォールドのin vitro生物学的特性評価

皮膚の傷を治療するために体内に足場を印刷する
全層創傷を誘発した後、創傷は対照として未治療のままにするか、固体の GelMA ハイドロゲルまたはワンステッププリントされた GelMA フォームで治療しました (図 6A)。感染を防ぐために、すべての傷口は半透性のテガダーム膜で覆われました。傷は定量化のために 12 日間撮影されました。興味深いことに、化学的に同一の材料を使用して固体ハイドロゲルとフォームを作成したにもかかわらず、これらのグループ間で観察された創傷閉鎖は研究全体を通じて有意に異なっていました (図 6B、C)。 12日後、固体ハイドロゲルとフォームスキャフォールドの創傷閉鎖率はそれぞれ54%と88%でした。結果は、定量的（図 6B）および定性的（図 6C）の両方において、固体ハイドロゲルの追加により、テガダーム対照群または多孔質フォームと比較して創傷閉鎖が妨げられることを示しました。これは以前の研究結果と一致しており、非常に小さな孔径を持つ固体ハイドロゲルは容易に生分解されず、再生細胞や免疫細胞によって侵入されないことを示唆しています。ここで提示した in vitro 分解および細胞培養の結果は、この事実をさらに裏付けています。一方、マクロ多孔性フォームは分解と細胞浸潤を促進し、固体スキャフォールドと比較して創傷閉鎖を大幅に加速しました（図6B、C）。この研究は、将来的にさまざまな生物学的因子の送達と組み合わせて創傷治癒を促進できるプラットフォーム技術として、ワンステップのインサイチューフォームプリンティングを開発することを目的として設計されましたが、フォームスキャフォールド単独では、創傷閉鎖の点でテガダーム対照群よりも優れており、9日目には統計的に有意な差が見られました。

図6 トランスレーショナルメディシンにおけるワンステッププリントフォームの実現可能性と再生能力を実証するための全層創傷マウスモデル

実験12日目の終わりに、創傷治癒の質を評価するために組織学的分析を実施した（図7）。ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色およびマッソントリクローム（MT）染色（図7A）では、すべてのグループで治癒の証拠が示されました。しかし、泡で治療した傷口では、肉芽組織が厚くなり、毛包が欠損部の中心に向かって成長していることから、より成熟し、治癒の兆候が進んでいたことが分かりました。対照的に、ハイドロゲル群の固体ハイドロゲルは、創傷端の進行を物理的にブロックすることで創傷閉鎖を妨げました（図7A、赤い矢印）。これは、固体ハイドロゲルは生分解性が遅く、細胞の浸潤や足場の再構築が容易ではないという私たちの仮説を裏付けるものであり、この問題はマクロ多孔性フォーム足場を適用することで解決できます。肉芽組織の厚さを定量的に測定したところ、同じパターンが確認され、ワンステッププリントされたマクロポーラスフォームで治療した創傷ではより厚い肉芽が形成される傾向がありましたが、この差は統計的に有意ではありませんでした（図 7B）。

図7 マクロポーラスフォームスキャフォールドによる皮膚創傷治療後の組織学的分析による創傷治癒の質の評価

2. まとめと展望
この研究は、組織工学および再生医療の分野におけるさらなる研究への多くの道を開くものです。今後の調査では、他の生体材料、バイオインクの配合、皮膚の傷の治癒以外の用途についても調査される可能性があります。印刷パラメータの微調整と他の潜在的な医療用途の探索は、この技術の応用範囲の拡大に役立ちます。さらに、この技術を大きな傷の治療に適したものにするために、ステッピングモーター駆動の注射器を使用する代わりに、カートリッジを外部に配置して蠕動ポンプに接続し、より大規模でリソースの少ない環境での使用をサポートすることもできます。生成される泡の容積は貯蔵カートリッジの容積の 3 倍であることを考慮すると、この戦略の携帯性を維持しながら、大量の治療用泡を生成することができます。提案されたワンステップの in situ バイオプリンティング法は、固体ハイドロゲルベースの足場の製造における既存の制限を克服する上で大きな前進となります。精度、再現性、汎用性を兼ね備えたこの技術は、再生医療や組織工学の発展に向けた有望なトランスレーショナルツールとなります。

ソース：
https://doi.org/10.1002/adhm.202401944

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