「マイクロ流体＋3Dプリンティング」で低コストの新型コロナウイルスRNA遺伝子センサーを作製

出典: MEMS

3D 印刷技術は、積層造形とも呼ばれ、連続する層の材料をデジタルで堆積させることで 3 次元の物体を製造し、航空宇宙、エネルギー機器、医薬品、医療機器、診断などに使用できます。 3D プリントは、カスタマイズされたセンサーコンポーネントを分散的にオンデマンドで生産するのに非常に役立ちます。 3D プリンターと比較すると、3D プリントペン (3D-PP) は安価で使いやすいです。

現在、SARS-CoV-2（新型コロナウイルス）によるCOVID-19の流行は、世界的に大きな緊急事態となっています。過去の流行ウイルスの経験に基づくと、症例の特定、接触者追跡、リスク管理におけるタイムリーな意思決定には、非常に感度が高く特異性の高い COVID-19 の臨床検査診断が不可欠です。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、その高い選択性と感度により、SARS-CoV-2検出の「ゴールドスタンダード」技術ですが、時間がかかり、中央研究室で専門の人員が操作する必要があります。したがって、ポイントオブケア（POC）アプリケーション向けの迅速で低コストかつ信頼性の高い分子診断検査ソリューションを開発することは、COVID-19パンデミックと戦うための緊急の必要性です。

このウイルスとの戦いでは、ラボオンチップとマイクロ流体チップが、サンプルの準備、反応、検出を小型デバイスに統合できること、少量のサンプルと試薬しか必要としないこと、高度な自動化、使い捨て使用、優れた携帯性など、独自の特性から広く使用されています。その中で、電気化学マイクロ流体デバイスは、分析性能を損なうことなく電気化学検出を容易に小型化できるため、重要な役割を果たします。さらに、この方法はSARS-CoV（コロナウイルス）の検出にも有効であることがすでに検証されている。

MEMSコンサルティングによると、プラハ化学技術大学無機化学部、先進機能ナノロボティクスセンター、中国医科大学付属病院研究部、ブルノ工科大学未来エネルギー・イノベーション研究所の研究者らで構成された科学研究チームが、3Dプリントペンで作られた針状のSARS-CoV-2遺伝子センサーを開発したという。研究者らは、化学的および電気化学的に活性化された3Dプリントペン電極に、SARS-CoV-2のN遺伝子配列を標的とする一本鎖DNA（ssDNA）プローブを吸着した。次に、SARS-CoV-2 遺伝子センサーを SARS-CoV-2 標的 RNA とともにインキュベートし、一本鎖 DNA プローブとハイブリダイズさせて、3D プリントされたペン電極表面への付加と脱着を引き起こしました。脱着後、ssDNAプローブ内のアデニンは、差動パルスボルタンメトリー（DPV）によって電気化学的に酸化されました。最終的に、このシステムは、単一の PDMS (ポリジメチルシロキサン) チャネルと出口側に挿入された 3 つの電極システムで構成されるマイクロ流体チップによって実現されました (下図を参照)。 3電極システムは完全に3Dプリントで作られています。このマイクロ流体遺伝子センサーは、「オン/オフ」モードで 7 分以内に SARS-CoV-2 ターゲット RNA を検出できます。

SARS-CoV-2ウイルス検出用ラボオンチップ遺伝子センサーの概略図
マイクロ流体電気化学遺伝子センサー

PDMS マイクロ流体チップは、以前に発表された研究に従って製造されました。チップは、開いたチャネル（断面 50 × 50 μm、長さ 1 cm）を含む PDMS 層、2 つのリザーバー層（直径 2 mm）、およびチャネルを閉じるためのガラス基板で構成されています。

PDMS マイクロチャネルと、3D プリントペンで作成された 3 つの電極を備えた電気化学セルで構成されるラボオンチップシステム。チップはチップホルダーに統合されており、ポンプパイプと電気化学セルの接続が容易になります。 Y コネクタを使用して 2 つのシリンジをマイクロチップの入口に接続します。 1 本の注射器には、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4、および COVID-SARS-2 RNA 溶液が含まれています。デュアルシリンジポンプを使用して、一定の速度で液体を注入します。さらに、プラスチック製の電気化学セル（容量 200 マイクロリットル）をマイクロチップの出口に挿入し、3 つの 3D プリントされたペン電極をセルに浸しました。作用電極（遺伝子センサー）は、マイクロチップチャネルの出口（出口リザーバー内、総容量 8 μl）に配置されました。

マイクロ流体遺伝子センサーは、3Dプリントされたペン電極をSARS-CoV-2の一本鎖DNAアンチセンスオリゴヌクレオチド（プローブ：5'-CCAATGTGATCTTTTGGTGT）で修飾することによって作製され、バイオセンシングにおいてSARS-CoV-2のN遺伝子配列を標的とする役割が確認されました。一本鎖 DNA とカーボンナノ材料間の π-π スタッキングを利用して、一本鎖 DNA プローブを活性化された 3D プリントペン電極の表面に物理的に吸着させ、遺伝子センサーを準備するために常に新しい 3D プリントペン電極が使用されるようにします。

遺伝子センサーのメカニズムは、差動パルスボルタンメトリーを使用して一本鎖 DNA 内のアデニンを酸化して信号を生成し、より大きなピーク面積を得るというものです。対照的に、SARS-CoV-2 RNA（ターゲット：5′-ACACCAAAAGAUCACAUUGG）の存在下では、SARS-CoV-2プローブの一本鎖DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドがSARS-CoV-2のRNAターゲットとハイブリダイズし、3Dプリントされたペン電極から脱着し、アデニンの酸化シグナルが減少し、酸化ピークが減少しました。

結論

研究者らは、3Dペンで印刷した電極（3D-PP）を使用して、SARS-CoV-2検出用の低コストの使い捨て遺伝子センサーを作成した。検知メカニズムは、SARS-CoV-2 の RNA ターゲットとの相互作用後の ssDNA プローブの脱着と、脱着されていない ssDNA のモニタリング（差動パルスボルタンメトリーによるアデニンの酸化信号）によるものです。この遺伝子センサーをラボオンチップシステムに統合すると、サンプルと試薬の消費を最小限に抑えながら、7分以内にSARS-CoV-2のRNAを検出できる「オン/オフ」センシングデバイスが実現します。さらに、この研究は、マイクロ流体工学と 3D 印刷技術 (特に 3D 印刷ペン) を組み合わせることで、汎用性があり、使いやすく、使い捨てで低コストのポイントオブケア検査用センシングデバイスを提供できることを示す有望な例です。

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