3Dバイオプリンティング技術における刺激応答性バイオマテリアルの応用

出典: Shangpu Biotechnology

刺激応答性バイオマテリアルは、構造形成、細胞成長、組織成熟に適した物理化学的および生物学的特性を提供できる 3D バイオプリンティングの重要な原材料です。最近、清華大学、米国ドレクセル大学、上海浦の研究者らが協力し、「3Dバイオプリンティングのための応答性バイオマテリアル：レビュー」と題するレビュー記事をMaterials Today（インパクトファクター＝31.04）に掲載しました。

背景と概要 このレビューでは、近年の押し出しベースの 3D バイオプリンティングにおける刺激応答性バイオマテリアルに基づくバイオインクの応用における重要な進歩に焦点を当てています。刺激応答性生体材料の物理化学的特性は、外部の物理的刺激（光、温度、機械的ストレス、電磁場など）、化学的刺激（pH、金属イオンなど）、生物学的刺激（酵素、代謝物、細胞牽引など）の影響下で制御可能な変化を起こします。対応する材料の反応には、物理的/化学的架橋、結合の切断、レオロジー特性の変化、形態の変化などが含まれます。押し出しバイオプリンティングには、バイオインクのせん断減粘性、迅速かつ制御可能なゲル化、生体応答性に関する特別な要件があります。そのため、刺激応答性バイオマテリアルは、インク設計、印刷構造のラピッドプロトタイピング、印刷体の生体活性において大きな応用可能性を秘めています。この記事では、バイオ 3D プリンティングの分野で一般的に使用されている刺激応答性バイオマテリアルをまとめ、印刷可能性、構造形成、細胞生存率、印刷体の生体活性の観点から、多機能応答性バイオマテリアルの応用戦略について説明します。同時に、単成分インク、多成分インク、ダイナミックインク、ナノ複合インクなど、バイオインクの主な調製基準と戦略が示されています。さらに、この記事では、懸濁支持印刷、バイオ4D印刷、印刷された薬剤放出キャリアなど、バイオ3D印刷における刺激応答性生体材料の潜在的な用途についても説明します。最後に、本稿では、刺激応答性バイオマテリアルの研究開発と製造、およびバイオプリンティング技術革新の観点から、革新的な多機能バイオインク設計の今後の発展方向を示します。

図1 3Dバイオプリンティングにおける刺激応答性生体材料の応用
刺激応答性生体材料の全体分類 刺激応答性生体材料は、その材料源と成分に応じて、天然ポリマー、合成ポリマー、複合ポリマーに分類できます。天然ポリマーは、動物、植物、藻類、微生物の発酵、酵素反応から得られます。天然ポリマーは化学構造に基づいて、主に多糖類、タンパク質、ポリヌクレオチドに分類されます。天然ポリマーは生体適合性が極めて高いため、バイオメディカル分野で幅広い用途に使用されています。合成ポリマーは、1 つ以上のモノマーを光または熱で重合させてホモポリマーまたはコポリマーにすることで形成されます。バイオプリンティングで使用される一般的な合成ポリマーには、ポリエチレングリコール (PEG)、ポロキサマー、ポリイソプロピルアクリルアミド (PNIPAAm)、ポリビニルアルコール (PVA)、ポリウレタンなどがあります。合成ポリマーハイドロゲルは通常、化学構造、分子量、親水性が明確に定義されており、物理化学的特性を正確に制御できます。複合ポリマーとは、環境刺激に対して特定のまたは複数の反応を実現するために、天然ポリマー、合成ポリマー、または無機分子や生物活性分子を組み合わせたポリマー材料を指します。複合生体材料の主な利点は、さまざまな特性を組み合わせて、単一のコンポーネントによってもたらされる制限を克服できることです。

印刷可能性における刺激応答性バイオマテリアルの重要性 印刷性に優れたバイオインクは、印刷ノズルをスムーズに通過し、形状保持能力と構造完全性が高い連続フィラメントを形成します。バイオインクの印刷性を評価する主な方法には、定性的な記述、定量的な測定、シミュレーションなどがあります (図 2)。バイオインクの印刷性に影響を与える要因は多数あり、その中には材料特性 (粘度、せん断減粘性、ゲル化速度、表面張力など) や印刷条件 (押し出し圧力、印刷速度、ノズルサイズ、温度制御など) が含まれます。刺激応答性バイオマテリアルは、外部刺激条件下で制御可能な物理的および化学的変化を示すため、バイオインクの印刷可能性を制御する上で重要な役割を果たします。表 2 は、刺激応答性バイオマテリアルによるバイオインクの印刷可能性を制御するための一般的な戦略を示しています。バイオインクは、構造の完全性と安定性を維持するために、押し出し後すぐに架橋する必要があります。刺激応答性バイオマテリアルは、せん断力、超音波、光、温度制御、pH 値、イオンなどの条件の変化によって架橋反応を起こすことができるため、バイオプリンティングプロセス中に刺激条件を調節することは、バイオインクの印刷可能性を調節する上で重要な部分です (図 3)。
図2 印刷適性の定量的および定性的な判定

図3 刺激応答性バイオマテリアルに基づく生体膜水架橋機構とバイオプリンティングにおけるその応用戦略
生体適合性における刺激応答性生体材料の重要性 印刷性を高める要因の中には、細胞生存率に悪影響を与えるものもあるため、良好な印刷性と高い細胞生存率を達成することはバイオプリンティングにおける永続的な課題となっています。たとえば、高粘度はバイオプリントされた体の構造的完全性と安定性に非常に有益ですが、高粘度のバイオインクを押し出すことによって生成される高いせん断力は、細胞の損傷、濃縮、または核溶解を引き起こす可能性があります。細胞の生存に影響を与える要因には、バイオインクの材料特性（レオロジー、粘度など）、印刷パラメータ（印刷速度、架橋時間、温度など）、細胞の種類などがあります。したがって、バイオインクの組成を調整し、印刷パラメータを最適化して高い細胞生存率（90% 以上）を維持することが、バイオプリンティングアプリケーションの重要なステップになっています。

生体活性材料は細胞と相互作用し、特定の細胞反応（増殖、分化、移動など）を引き起こすことができるため、バイオインクの生体活性は細胞培養とバイオプリントされた組織構造の成熟にとって重要です。一般的に、生物活性を高めるための戦略には、天然ポリマーと生化学的因子（成長因子、サイトカイン、タンパク質など）の混合、生物活性モチーフ（ペプチド配列、成長因子など）の化学的結合、脱細胞化細胞外マトリックス（dECM）バイオインクの使用などがあります。
図4 印刷中の細胞損傷メカニズムと生存率
バイオインク調製戦略の概要 刺激応答性バイオマテリアルに基づくバイオインクの配合は、印刷性、生体適合性、生体活性、機械的特性などの一連のバイオインク設計基準に従います。刺激応答性バイオマテリアルを使用してインクを設計するための戦略は、一般的に、単一成分インク、複数成分インク、動的インク、ナノ複合インクの 4 つがあります。 1 成分バイオインクは、適切なレオロジー特性と生体模倣特性を備えた単一成分の生体材料に依存しています。多成分インクの複雑な構成と多重応答メカニズムと比較すると、単成分バイオインクは制御性と印刷プロセスがより単純であるため、場合によってはバイオプリンティングに適した選択肢となる可能性があります。多成分インクは、インク設計において複数の刺激応答性コンポーネントを組み合わせることで、さまざまなバイオインク成分の利点を統合することができます。動的インクの代表的な例としては、自己組織化して超分子ネットワークを形成できるバイオインクの調製が挙げられます。これらのバイオインクの成分は、非共有結合および/または超分子構造を形成し、一般に顕著なせん断減粘特性を備えています。ナノ複合バイオインクには、ナノファイバー、ナノチューブ、ナノ粒子、その他のナノ材料などのナノスケールのコンポーネントが含まれています。インクにナノ材料を添加すると、優れたせん断減粘特性、細胞応答性、および押し出しベースの 3D バイオプリンティングに適した機械的特性が得られることが実証されています。

フロンティアと展望
3D バイオプリンティングは、生体適合性材料の印刷から、組織再生や個別化医療のための生きた細胞やオルガノイドベースのバイオインクの印刷へと進化しました。これは、生体模倣の複雑さを備えた生物学的モデルを作成するために使用される最先端技術です。過去 10 年間、複雑な構造、高解像度、生体適合性を備えたバイオプリンティングの需要により、革新的なバイオインクとバイオプリンティング戦略の探求に多大な努力が払われてきました。

剪断流動性またはチキソトロピー特性を持つ生体材料もサスペンションプリンティングのサポート媒体として使用されており、従来のバイオプリンティングでは印刷できない材料や構造の使用が可能になっています。 Lee らは、ヒトの心臓部品を製造するために懸濁ハイドロゲル印刷戦略 (FRESH) を提案しました。 FRESH は、熱応答性ゼラチン微粒子のスラリーで作られた支持浴にコラーゲンを印刷することによって実行されます。支持媒体中の押し出されたコラーゲンのpH駆動架橋後、ゼラチン支持媒体は37℃でスムーズに除去することができた（図4A）。

4D 生物学は 3D プリンティングから進化し、時間を第 4 次元として導入します。刺激に反応する生体材料を印刷して得られる 4D プリント生体模倣構造は、外部または内部の刺激に応じて形状変化を起こします。 4D バイオプリンティング技術により、複雑な組織構造の製造と、オンデマンドの形状変換の動的制御が可能になります。 Kirillova らは、自己折り畳み式の管状構造の 4D バイオプリンティング法を開発しました。架橋中に印刷体の異なる高さでの材料の光吸収率が異なるため、架橋勾配が生成されます。水溶液に浸漬した後、2D構造は膨張係数の差により管状構造に折り畳まれます（図4B）。

刺激に反応する生体材料は生物学的環境と通信する固有の能力を持っているため、薬物の送達媒体として使用することができます。これらの「スマート」な生体材料は、膨張/収縮、結合の破壊、表面の変化、構造の変化などのメカニズムを通じて、生物学的および病理学的信号に反応することができます。輸送システムからの制御された薬物放出は、自己調節または外部または内部刺激による直接的/段階的な活性化によって達成されます。 Bozuyuk らは、メタクリルアミドキトサンと超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (SPION) で作られたマイクロスイミングデバイスを印刷しました (図 5C)。インクは、2光子直接レーザー書き込みを使用して二重らせん形状に製造されました。回転磁場が存在する場合、マイクロスイマーは 3.34 ± 0.71 μm·s-1 の速度で移動できます。化学療法薬のドキソルビシンはアジドで修飾され、光分解性分子のアルキン末端に組み込まれました。 365 nmの紫外線を照射すると、リンカー分子が切断され、薬剤が放出されました（図4C）。

印刷プロセス中の印刷性と細胞生存率の不一致は、まだ解決されていません。天然組織の複雑さ、機械的特性、解像度を備えたボリュームを印刷することは、依然として大きな課題です。私たちは、バイオプリンティング技術の進歩を導く将来の研究開発には 2 つの道があると考えています。 1 つ目は、既存の印刷技術に基づいて、新しい刺激応答性生体材料を設計し、適切なバイオインクに準備することです。具体的には、バイオインクの開発では、配合、架橋メカニズム、細胞適合性、および生体活性に重点を置く必要があります。十分に研究されたハイドロゲルシステムに基づく複合バイオインクの調製は、バイオインクの開発にとって便利な戦略となる可能性があります。同時に、多機能応答性ハイドロゲルシステムを調製するための新しい化学合成方法の使用は、3D バイオプリンティング用の新しいバイオインクを開発するための選択肢として常に存在してきました。天然の生物組織形成の動的プロセスを考慮すると、動的粘弾性を備えた応答性材料は 3D バイオプリンティングに有望な用途があると考えられます。もう一つのアプローチは、生体材料の刺激応答特性を活用して、革新的なバイオプリンティング技術と戦略を開発することです。さらに、バイオプリンティング結果の標準化を実現するために、関連する印刷可能性評価方法を確立する必要があります。バイオプリンティング関連のパラメータと物理モデル間の効果的な接続を確立することは非常に難しいことを考慮すると、機械学習は、構造の調整、印刷性の調整、構造欠陥の検出など、さまざまな方法で印刷プロセスを最適化することでバイオプリンティングの結果を改善できる強力で効果的なツールです。全体として、生物学的または病理学的シグナルに反応する生体材料は、精密医療、薬物送達、再生医療、組織工学のアプリケーションにおいて大きな可能性を秘めていると考えています。

図5 刺激応答性バイオマテリアルのサスペンションプリンティング、バイオ3Dプリンティング、プリンティング薬物放出キャリアへの応用

出典: Z. Fu、L. Ouyang*、R. Xu、Y. Yang、W. Sun*、「3D バイオプリンティング向けレスポンシブバイオマテリアル: レビュー」。Materials Today、https://doi.org/10.1016/j.mattod.2022.01.001

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