この3Dプリントされたバイオセラミックス足場は、生物学的に活性であり、機械的にも強い。

出典: EngineeringForLife

多孔質リン酸カルシウムセラミックは、その優れた生体活性により幅広い注目を集めています。しかし、その機械的特性の悪さから、臨床応用は大きく制限されています。多孔質 CaP セラミックスの生体活性を維持しながら機械的強度を大幅に向上させることは、依然として大きな課題です。

この問題を解決するために、四川大学のファン・ユージャン教授と周長春研究員のチームは、硫酸カルシウムを使用して、セラミック焼結プロセス中のハイドロキシアパタイト粒子の方向性成長を制御しました。インサイチュ配向粒子は応力集中を緩和するだけでなく、セラミック粒界間の結合力も強化します。硫酸カルシウムは、リン酸カルシウムセラミックス内の活性カルシウムイオンの放出を促進し、生体内での生体活性と骨形成特性をさらに高めます。超臨界骨欠損修復モデルでは、欠損修復は3か月以内に完了し、機械的回復は自家骨の70％以上に達しました。

関連する研究成果は、2024年11月13日に「超臨界骨欠損再建のための粒子の原位置配向成長によって強化された3Dプリントバイオセラミックス足場」というタイトルでAdvanced Scienceに掲載されました。

1. その場ウィスカー強化セラミックスの作製 まず、DLP 技術により HAP-CaSO4 バイオチェーンを使用して高精度のセラミックグリーン体を作製しました。焼結プロセス中、CaSO4 は HAP 粒子の配向成長を制御し、その場でウィスカー構造を形成します (図 1a)。作製された多孔質セラミックス足場は図 1b、c に示されており、明確な輪郭と多孔質構造を有しています。研究者らは、5%、10%、20%、30%のCaSO4を含む3Dプリントセラミックグリーンボディを準備した。剥離後、サンプルは900℃で10時間保管され、焼結されてウィスカーセラミックサンプル（それぞれ5、10、20、および30 SH）が得られました。その微細構造を図1d-gに示します。 EDSおよびXRDにより、材料はCaSO4とHAP結晶のみで構成されており、生成されたウィスカーはHAPであると特定された（図1h～j）。

図1 インサイチューウィスカー強化セラミックス（IWRC）の作製
2. 機械的性質 研究者らは、セラミックスの機械的特性に対する原位置ウィスカー構造の影響を理解するために、気孔率68%の固体セラミックスと多孔質セラミックスを3Dプリントし、圧縮試験を実施しました（図2a-d）。多孔質セラミックスの応力-ひずみ曲線は、すべての足場が脆性破壊を示すこと、つまり材料が破壊された後に応力が急速に低下することを示しています。材料のナノメカニカル特性は、原子間力顕微鏡（AFM）を使用してさらに調査され、HAP および 20SH サンプルの力-変位曲線が、粒子および粒界上の 3 つの異なるポイントで測定されました（図 2f-m）。結晶内部のヤング率は粒界のヤング率よりも大幅に高くなります。材料のナノメカニカルマップにより、セラミック粒子の位置における力が粒界における力よりも大きいことが確認されました。破壊形態から、ウィスカー強化セラミックスには粒界破壊と粒内破壊の 2 つの破壊モードがあることがわかります。一方、純粋な HAP セラミックスでは粒界破壊のみが見られます (図 2n-o)。

図2 機械的性質
3. 機械的補強機構 ウィスカーの原位置強化のメカニズムをさらに理解するために、研究者らはセラミックの微細構造特性に基づいて、2次元単層構造の簡略化されたモデルを設計しました。元のHAP粒子は球状に単純化され、柱状のウィスカーは柱状に単純化されました（図3a）。図 3c からわかるように、ウィスカーの存在によりブラケットの変形抵抗が大幅に向上します。応力等高線図では、ブラケットがない場合、微細孔に明らかな応力集中があることがわかります。過渡モデルシミュレーションの結果は、セラミックマトリックス内の柱状ウィスカー構造が応力集中を効果的に緩和し、損傷の発生を遅らせ、スキャフォールドの機械的特性を向上させることを示しています（図3e）。

図3 機械的強化機構の有限要素解析
4. 増殖と分化 その後、研究者らは、IWRCの分解速度はCaSO4含有量に比例し、Ca2+の初期放出は主にCaSO4の溶解によって引き起こされることを発見しました（図4a-c）。骨髄間質細胞 (BMSC) を使用して、ウィスカー強化スキャフォールドと HAP スキャフォールドの in vitro 生体適合性を評価しました。結果は、すべてのスキャフォールド上の細胞が顕著に増殖し、10% - 30% wt.% CaSO4 を添加しても幹細胞に対する細胞毒性効果は生じないことを示しました (図 4h)。レーザー走査共焦点顕微鏡により、4 つのセラミックスキャフォールド上の BMSC の増殖をさらに比較しました (図 4e)。

BMSCs を骨形成誘導用のスキャフォールドに移植した後、IWRC が BMSCs の骨形成分化に及ぼす影響を観察しました。アルカリホスファターゼ（ALP）染色では、30 SHおよび20 SH ALPが強く発現していることが示され、これは早期の骨形成分化の誘導に役立ち、BMSCsのカルシウム結節の密度は後期に高くなりました（図4f）。いくつかの骨形成関連タンパク質の免疫蛍光検出により、Runx2、Col1、オステオカルシン（OCN）、およびオステオポンチン（OPN）が30SHおよび20SHサンプルの両方で高度に発現していることがわかった（図4g）。

図 4 骨髄間葉系幹細胞の 3D プリント IWRC の in vitro 評価骨形成分化の分子メカニズムをさらに研究するために、研究者らは、骨形成成長因子の非存在下で HAP と 20 SH とともに 21 日間培養した骨髄間葉系幹細胞のトランスクリプトーム解析を実施しました (図 5)。結果は、PI3K-ART、TGF-β、Wntシグナル伝達経路が効果的に活性化され、その中でTGF-βシグナル伝達経路が最も高い濃縮スコアを示したことを示しており、これが骨形成分化の促進において主導的な役割を果たしていることを示唆しています。

図5 骨髄間葉系幹細胞の骨形成分化のトランスクリプトーム解析
5. IWRC異所性骨形成 IWRCの骨修復能力を評価するために、研究者らは4つのグループのスキャフォールド（30 SH、20 SH、10 SH、およびHAP）をビーグル犬の傍脊柱筋に3か月間移植し、骨形成を観察しました（図6a）。移植から3か月後、材料は筋肉組織から除去されました。スキャフォールドは周囲の筋肉組織としっかりと一体化しており、繊維が閉じ込められる兆候もなく組織はスキャフォールドの内部に成長しました（図6b）。染色組織学的分析では、20SH以内に連続した骨組織が観察されたことが示された（図6e-g）。 ImageJ ソフトウェアを使用した半定量分析では、ウィスカー強調グループの体積が HAP グループよりも有意に大きいことが示されました (図 6c)。これは、インサイチューウィスカー強化セラミックスが骨誘導特性を保持し、HAPセラミックスよりも優れており、さらなる応用の可能性を示していることを示しています。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（トラップ）染色により、4 つの材料グループに破骨細胞が現れ、材料の表面にしっかりと付着していることが示されました。これは、誘導された骨組織が自己再構築機能を持っていることを示しています（図6h-k）。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、20SH群のRunx2 mRNAレベルとOPN発現は他の3つの群よりも有意に高かったことが示された（図6l-o）。

図 6 生体内骨誘導評価 IWRC が骨形成能を高めるメカニズムをさらに解明するために、研究者らは皮下移植から 1 か月後にスキャフォールドの定量的プロテオーム解析を実施しました (図 7)。結果は、IWRC が AHSG、ACP5、IGF2、SPP1、MGP などの骨形成関連タンパク質の発現を通じて骨形成を促進する可能性があることを示しました。その中で、カルシウムイオン関連タンパク質F2とFFAR2は骨形成関連タンパク質の発現を相乗的に制御します。

図7 プロテオミクス定量分析
6. 超臨界骨欠損再生におけるIWRCの役割 IWRC が前臨床の超臨界骨欠損における骨再生を促進する能力を評価するために、15 mm ウサギ大腿骨骨切り欠損モデルが確立されました。図 8a は、修復後の 3D 再構成画像、単層レントゲン写真、および四分の一断面画像を示しており、移植後 1 か月と 3 か月のスキャフォールドと大腿骨の全体的な形態を比較しています。マイクロCT画像から、10SH群と20SH群では、新しく形成された骨組織が連続した構造に融合し、スキャフォールドが骨欠損の両端と融合していることが明確に観察されます。半定量分析の結果と組み合わせると、骨梁厚（Tb.Th）の増加と骨梁間隔（Tb.Sp）の減少に伴って、新生骨の割合（BV/TV）と新生骨密度（BMD-BV）が増加することがわかりました。 3 か月時点での 3 つのグループにおける新しい骨の量と密度の変化傾向は、1 か月時点での傾向と一致していました。

図8 超臨界骨欠損再生に対するIWRCの効果。材料と骨組織の統合は光学顕微鏡を使用して観察されました。移植後1か月で、材料の多孔質構造は新しく形成された組織で満たされ、線維性被膜は検出されなかった（図9a）。移植後3か月で、材料と骨組織はしっかりと一体化し、それらの境界は完全に不明瞭になりました。スキャフォールド内で新たに形成された組織の色と形態は、宿主骨のものと非常に類似していました (図 9b)。図 9c～e に示すように、新しい骨組織がスキャフォールド材料をしっかりと包み込み、新しい組織がセラミック粒子の表面に沿って増殖し、IWRC の生体適合性と生体活性が確認されました。染色結果によると、移植後1か月で欠損部は徐々に治癒し始め、スキャフォールドは宿主骨と部分的に融合していたことが示されました（9g-i）。移植後3ヵ月で、20SH群のスキャフォールド構造は明瞭となり、両端は宿主骨と完全に融合した（図9j-l）。新しい骨組織は、外縁に沿ってスキャフォールドのほぼ全体に広がっており、組織の方向は宿主の皮質骨の方向に近いものでした。新しい骨組織は密度が高く、宿主の皮質骨に似ており、新しい骨には多数のハバース管が見られ、骨組織が成熟していることを示していた。

図 9 新しい骨組織の形態要約すると、本論文では、CaSO4/HAP セラミックススラリーを使用して高精度の多孔質セラミックス足場を印刷し、焼結プロセス中に粒子配向の成長を制御して、機械的に強化された粒子配置構造を実現しました。 CaSO4 は IWRC セラミックス内の活性 Ca2+ の放出を促進し、HAP の骨誘導能力を大幅に向上させます。トランスクリプトミクスとプロテオミクスの結果は、IWRC がカルシウムイオン経路と骨形成関連タンパク質の発現を活性化できることを示しました。前臨床動物実験では、IWRC はわずか 3 か月で超臨界骨欠損の修復を達成し、機械的修復率は自家骨の 70% を超えました。本研究では、多孔質セラミックスの生体活性と機械的強度の矛盾を調整し、CaPセラミックスの生体活性と機械的強度の二重の最適化を達成することに成功しました。

ソース：
https://doi.org/10.1002/advs.202408459

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