《Bioact. Mater.》: 高い機械的安定性を備えた3Dプリントバイオハイドロゲル

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

3D プリンティングでは、ミクロンレベルでの構造の制御が可能になり、複数の細胞タイプの配置を正確に制御して、本来の組織に一致する複雑な構造を作成できます。バイオハイドロゲルは、生体適合性、明確に定義された細胞接着リガンド、および生分解性を備えており、細胞の移動を可能にし、高分子や小分子の輸送に好ましい条件を提供するため、細胞 3D 印刷用のバイオインクとして広く使用されています。ハイドロゲルは、天然組織と同様の粘弾性特性を持ち、通常はせん断弾性率が低く、場合によってはせん断減粘挙動を示すため、細胞が存在する状態でも容易に押し出し印刷を行うことができます。フィブリン、ゼラチンメタクリレート (GelMA)、コラーゲンメタクリレート (ColMA) などのハイドロゲルは、さまざまな用途のさまざまな構造のバイオファブリケーションのゴールドスタンダードと考えられています。例えば、GelMA は、組織工学、特に血管新生や心臓組織工学、3D プリントのバイオインク、再生医療における創傷治癒用の接着インクなど、幅広い用途があることから大きな注目を集めています。しかし、3D プリントされた細胞を含んだ構造物における幾何学的および構造的完全性は、細胞の圧縮とハイドロゲルの収縮により、時間の経過とともに劣化することがよくあります。

カナダのトロント大学のミリカ・ラディシック氏のチームは、バイオハイドロゲルの細胞適合性と弾性ポリマーの機械的安定性を組み合わせて、ステレオリソグラフィーと押し出し3Dプリント後の構造忠実性を維持する新しいアプローチを開発しました。この進歩は、ポリ（オクタメチレン無水マレイン酸クエン酸塩）（POMaC）の弾性微粒子をバイオ由来のハイドロゲル（フィブリン、ゼラチンメタクリレート（GelMA）、アルギン酸塩）に統合して配合された複合バイオインクによって達成されました。この複合バイオインクは、3D プリントされた構造物の弾力性と可塑性を高め、組織の圧縮と腫れを効果的に軽減しました。低いせん断弾性率と速い架橋時間、高い極限圧縮強度、細胞力と物理的操作による変形に対する耐性を備えています。これは弾性粒子のパッキングと応力分散によるもので、数学的モデリングによって確認されています。生体内移植研究では、POMaC 粒子を含む構造体は、宿主組織のストレスに対する耐性が向上し、血管新生が促進され、修復マクロファージの浸潤が促進されることが実証されました。関連研究は、2024年10月29日にBioactive Materials誌に「安定した3Dプリント構造の設計と移植のための複合バイオインクにおける細胞駆動型エラストマー粒子パッキング」というタイトルの記事として掲載されました。

1. 革新的な研究内容<br /> ここでは、生物学的ハイドロゲルと弾性ポリマーの利点を組み合わせて、ステレオリソグラフィーと押し出し 3D 印刷に適した複合粒子バイオインクを形成する方法を紹介します (図 1)。弾性微粒子をバイオ由来のハイドロゲルに組み込むことで、天然ハイドロゲルのサポートにより細胞表面の生物学的特性を保持し、高ひずみ下でポリマーエラストマーと同様の機械的特性を示すバイオインクを設計しました (図 1a)。これらの弾性微粒子は、クエン酸、無水マレイン酸、1,8-オクタンジオールから重縮合により合成された紫外線架橋性エラストマーである POMaC を使用して、バッチおよび液滴マイクロ流体法によって生成されました。この細胞適合性エラストマーは、これまで心臓組織工学の足場として使用されており、細胞の成長をサポートし、in vitro 臓器オンチップモデルや in vivo 埋め込み型圧力センサーの作成を可能にしてきました。さらに、POMaC は、体外血管新生を促進するプラットフォームである AngioChip の製造にも使用されました。

【3Dプリント用安定形状複合粒状材料】
研究者らは、POMaC 粒子をさまざまなハイドロゲル (具体的にはフィブリン、GelMA、アルギン酸塩) に埋め込み、間質細胞、線維芽細胞、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞によるリモデリングと組織生成をサポートし、血管新生を強化するとともに、構造標識用の蛍光を追加する多用途の粒子状バイオインクを作成しました (図 1a および b)。マイクロメカニカル圧縮試験の結果は、複合材料が広範囲のひずみにわたって親ハイドロゲルと同様の挙動を示すことを示しており (図 1b)、これは押し出し 3D 印刷に適しています。せん断圧縮試験では、低ひずみでは変形は主にハイドロゲル成分を介して伝達され、複合粒子バイオインクは親ハイドロゲルとほぼ同じ機械的特性を示したことが示されました（図 1c）。しかし、圧縮せん断ひずみが増加すると、変形がハイドロゲルを介して伝達され、弾性粒子が互いに接触して、加えられた変形に抵抗するようになります (図 1c)。したがって、複合バイオインクは、より高いひずみでは弾性固体のように動作し、最終的には元のハイドロゲルよりも大幅に高い極限引張強度を示します (図 1c)。有限要素モデリングにより、構造が同じ圧縮変位を受けた場合、複合材内のフォンミーゼス応力はハイドロゲル単独の場合と比較して減少することが示され (図 1d)、複合材の圧縮抵抗能力がさらに裏付けられました。これらの二峰性の機械的特性により、粒子複合材は細胞培養および移植において独特の挙動を示すことができます。

図1. 3Dプリント構造を安定化するための複合ハイドロゲルバイオインクにおける弾性粒子の積み重ね
POMaC 粒子は、バッチ合成アプローチまたはマイクロ流体技術を使用して、POMaC プレポリマーとポリエチレングリコールジメタクリレート 500 (PEGDM) を混合することによって生成されます (図 2)。バッチ合成では、連続的に撹拌された PVA 溶液に POMaC ポリマーを注入する懸濁重合法が使用されました。その結果、POMaC プレポリマーは PVA 溶液でカプセル化された後、自発的に粒子を形成しました (図 2d)。次に、これらの粒子を濾過して目的のサイズに分離し、UV 架橋処理を行いました (図 2d)。また、単分散POMaC粒子を生成するための概念実証として、液滴マイクロ流体工学を採用しました（図2ei）。ここでは、PDMS デバイスで従来のフローフォーカスインターフェースを使用しました (図 2eii)。高粘度の POMaC 粒子の付着を抑制し、PDMS チャネルを湿らせるために、20 ゲージの注射針を PDMS チップに横向きに挿入し、連続相チャネルと交差させました。粒子はチューブに集められ、その後紫外線下で架橋されました（図2ei）。

図2 バッチ法とマイクロ流体法で調製したPOMaC粒子の比較分析
3Dプリント用のハイブリッドPOMaC粒子とハイドロゲルバイオインク

細胞活性を維持しながら優れた機械的安定性を備えた 3D プリントバイオインクを開発するために、POMaC 粒子をさまざまなハイドロゲルと統合しました。このバイオインクには細胞を加えることもでき、さまざまなハイドロゲルと互換性があります (図 3a)。粒子がハイドロゲル構造内に均一に分散されるようにするには、印刷前に粒子/ハイドロゲル溶液を十分に混合する必要があります。粒子を試験管内で数分間放置すると、沈殿する傾向があり、印刷構造に不一致が生じたり、押し出し印刷の場合はノズルが詰まったりする可能性があります。まず、100 μm より大きい粒子と 100 μm より小さい粒子を含む PEGDA ハイドロゲル構造を比較して、粒子サイズが印刷性能に与える影響を調査しました。印刷が完了した後、構造が画像化され、元の設計との違いが定量化されました。調査した条件下では、有意な差は観察されませんでしたが、粒子が大きくなるほど、また粒子濃度が減少するにつれて、差が増加する傾向が観察されました。 GelMA/POMaC 粒子と GelMA コントロールの 3D プリント構造の走査型電子顕微鏡 (SEM) 分析により、POMaC 粒子によってもたらされる形態変化が明らかになりました。これらを組み込むことで、ハイドロゲルマトリックスに望ましいテクスチャの複雑さが導入され、機械的特性と細胞接着特性の改善に寄与することが観察されました（図3b）。

本論文では、POMaC 粒子を豊富に含むバイオインクの応用範囲を拡大するために、さまざまな 3D 印刷モードとの互換性を調査しました。具体的には、本論文では、高解像度と高精度で知られる方法であるステレオリソグラフィーバイオプリンティングを実験しました (図 3ci-iii)。さらに、本論文では、汎用性、拡張性があり、材料の多様性にも優れた方法である押し出し印刷についても研究した（図3civ-vi）。私たちの研究結果は、このハイブリッドバイオインクが複雑な構造の製造を容易にすると同時に、印刷後の画像化や追跡に使用できる自己蛍光特性を構造に付与することを示しています（図 3d）。さらに、フィブリン、アルギン酸塩、GelMA などのさまざまなハイドロゲルを使用したバイオインクの印刷機能を実証することにも成功しました (図 3e)。

図3 POMaC粒子をさまざまなハイドロゲルに統合して、さまざまな3D印刷アプリケーションに適したハイブリッドバイオインクを作成します。
ハイブリッドPOMaC粒子-ハイドロゲルバイオインクは構造物の機械的特性を向上させます

ここでは、POMaC 粒子が PEGDA ハイドロゲルに添加され、PEGDA のみからなる対照群と比較して膨潤の減少が観察されました。この減少は、ハイドロゲルマトリックスに埋め込まれた粒子によってもたらされる抗力によるものだと私たちは考えています (図 4a～c)。マイクロメカニカルテスターを使用してヤング率を測定したところ、粒子を含むハイブリッド 3D プリントアルギン酸構造の弾性は、アルギン酸のみを含むコントロールグループよりも大幅に高いことが示されました (図 4d～f)。組織工学構造物は、最終的に生体内でその機能性を維持するために、細胞培養および生体内移植に必要な操作ステップ中にその形状を維持し、無傷のままでなければなりません。私たちの実験では、3D プリントの前に GelMA に粒子を追加すると、破損しにくい構造が得られることがわかりました (図 4g)。圧縮試験（図 4h）によりこの改善が確認され、POMaC 粒子を含む構造物はヤング率が大幅に向上し（図 4i）、極限圧縮強度も向上しました（図 4j）。

図4 POMaC粒子をハイドロゲルに加えると機械的安定性が向上する
3DプリントされたGelMA構造に組み込まれたPOMaC粒子は心筋細胞の接着と収縮機能を強化します

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）由来心筋細胞（CM）をPOMaC/GelMA 3Dプリント構造物に播種し、その発達を監視しました。細胞は10日間培養され、その間に細胞は増殖し、収縮活動を示すようになりました（図5a）。トロポニンT（TnT）染色はより強力な心臓組織形成を示しており、これは画像解析ツールによってさらに定量化されました（図5bおよびci）。心臓機能も評価され、その結果、励起閾値の低下（図 5cii）と最大捕捉率の増加（図 5ciii）によって証明されるように、粒子を含む構造の改善が示されました。さらに、1 Hz刺激下では、POMaC含有粒子の構造変位振幅はより大きくなった（図5civおよびd）。

図5 POMaC粒子は3DプリントされたGelMA構造における心筋細胞の接着と収縮機能を強化する
POMaC粒子は複合構造におけるin vitro血管安定性を高める

血管新生は組織工学戦略の成功に不可欠です。この目的のために、我々は、弾性 POMaC 粒子（GelMA とフィブリン）を組み込んだ 2 つの異なるマトリックスに内皮細胞と支持細胞（歯髄幹細胞（DPSC））を一緒に播種しました（図 6a）。 GelMA/POMaC 粒子構造では血管新生が促進され、血管径が著しく広くなりました (図 6b および c)。

図6 血管形成および血管組織構造におけるPOMaC粒子の安定性への影響[POMaC粒子は複合構造における血管新生および再生促進マクロファージの動員を促進する]

ハイドロゲルスキャフォールドの長期安定性、構造的完全性、機能性をさらに調査するために、生体内研究は最初の 10 日間から 2 週間と 4 週間に延長されました。 2 週目に除去したスキャフォールドの全体的な形態学的画像では、粒子を含むスキャフォールドは、粒子を含まないグループと比較して、スキャフォールド面積が小さいことが示されました (図 7a および b)。これは、細胞浸潤の促進とそれに続く物質の劣化によるもので、粒子が存在するとそれがより顕著になると私たちは考えています。粒子と播種細胞（EC / DPSC）を含むグループでは、肉眼的形態の観点から、スキャフォールド内血管新生が増加したという明確な証拠がありました（図7a）。注目すべきことに、すべてのスキャフォールドは摘出時に無傷のままであったものの、組織学的分析により、粒子のないスキャフォールドは不安定であり、粒子のないスキャフォールドでは著しいせん断と引き裂きが観察され（図 7c および d）、粒子のないグループではより多くのハイドロゲルが残っていることが明らかになりました。

図7 細胞の有無にかかわらずPOMaC粒子/GelMAインプラントの長期生体内移植

さらに、POMaC粒子を含むグループでは、CD31陽性染色によって定量化された血管透過性が有意に増加していることが実証されました（図8aおよびb）。さらに、インプラントへのマクロファージの浸潤を調査し、4 週間で採取したサンプルで、総マクロファージのマーカーである CD68 と、組織に浸潤する再生促進性、血管新生促進性マクロファージのマーカーである CD206 の染色で有意な増加が観察されました (図 8c-f)。これらの発見は、POMaC 粒子が血管新生と再生促進マクロファージ浸潤を促進するだけでなく、足場の構造的完全性を維持し、それによって生体内での組織の統合と再生の長期的プロセスをサポートするという重要な役割を担っていることを浮き彫りにしています。

図8 GelMA構造物にPOMaC粒子を添加すると、インプラント内で血管新生と再生促進マクロファージ浸潤が誘導される
2. まとめと展望<br /> ここで実証された技術は、構造の忠実性と生物学的機能性のバランスを実現する 3D バイオプリンティング技術の開発に向けた有望な手段です。複合インクはさまざまな印刷方法やハイドロゲルに適応できるため、POMaC 粒子ハイブリッドバイオインクは、生体材料科学、組織工学、再生医療の応用を進歩させるためのさまざまな構造的および機能的要求を満たす可能性を秘めています。

ソース：
https://www.sciencedirect.com/sc ... 24004523?via%3Dihub

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